粘度和分子量测量多糖的特征

凝胶排阻色谱(SEC)是一个分析技术被广泛用于分析因素如分子量、聚合和复苏的蛋白质。光散射检测器的组合和浓度检测器(紫外或折射率,RI)交会使分子量测定蛋白质的保留时间独立的。这是非常有用的,因为没有球状结构对于大多数蛋白质,从而导致测量不准确的分子量。

仪表

包含更多的探测器,如动态光散射(DLS),固有粘度(IV),和第二个浓度检测器可以帮助获得更多的数据从一个交会测量。就是这样一个仪器如图1所示的莫尔文Panalytical SEC-MALS 20日20角光散射装置,可以使测量分子量的蛋白质洗脱体积无关。

图1所示。的Viscotek SEC-MALS 20系统。

实验的程序

在这一分析,证券交易委员会是用于分离蛋白质的数量,其次是分子量由传统的校准测量和多角光散射(mal)和获得的结果的比较。TDA RI探测器是用来连接SEC-MALS 20系统Viscotek TDAmax浓度测量系统。磷酸盐作为流动相分离样品沿着2 x Viscotek蛋白质溶解所有列的样本在移动阶段。

牛血清白蛋白,一个定义良好的分子量蛋白质,用于校准SEC-MALS 20系统。列校准进行了一连串的球状蛋白质(蛋白质凝胶过滤标记工具包分子量29000 - 700000 Da, Sigma-Aldrich)。列和探测器都保持在30°C实现有效分离和优化基线探测器的稳定性。

实验结果

检查校准总是有利于系统验证和BSA二聚体中经常发现的BSA样品是一位杰出的验证标准。在这个分析,二聚物的分子量是准确测量,甚至三聚物的也以高度的精度。

BSA色谱图如图2所示,BSA测量结果表1中列出。对BSA SEC-MALS 20的色谱检测器信号如图3所示。

图2。色谱的BSA RI(红色)和SEC-MALS(90°)(橙色)检测器的信号。

图3。色谱对BSA SEC-MALS 20探测器的信号。

表1。测定分子量对BSA单体、二聚体和三聚物。

	三聚物	二聚体	单体
峰RV - (ml)	14.31	15.37	17.05
(Mn) - kDa	203.8	135.2	66.4
(Mw) - kDa	204.4	135.3	66.5
Mw /锰	1.003	1.001	1.001
Wt Fr(峰值)	0.054	0.165	0.78

探测器响应和峰值大小相同的各向同性散射体在每个角度。分子量被认为很稳定在所有这些山峰,表明它们是单分散的。和分子量的值表明这些山峰BSA不同低聚物。

从传统校准的数据如图4所示。碳酸酐酶的折射率信号是色谱图中描述。传统的校准是用来测量BSA二聚体和三聚物的分子量,和相应的结果在表2中列出。表2的数据可以相比SEC-MALS表1中的数据。

图4。色谱柱的碳酸酐酶覆盖校准曲线。

表2。BSA的分子量低聚物峰以列校准。

	三聚物	二聚体
峰RV - (ml)	14.32	15.33
(Mn) - kDa	341.1	198.4
(Mw) - kDa	345.1	202.2
Mw /锰	1.012	1.019
Wt Fr(峰值)	0.021	0.103

准确的分子量测定与列校准寡聚物是不可能的,因为这些低聚物的结构不再是球状的单体。此外,列的分子量测定的准确性校准不能反复核对由于缺乏光散射。因此,这些山峰错误可以分为三聚物和五聚物。

然而,光散射结果如表1所示正确帮助识别二聚物和三聚物分子量通过精确测量。最后,胃蛋白酶的分子量是衡量校准和SEC-MALS列。图5显示了色谱光散射结果和表3提供了一个计算分子量的比较。

图5。色谱的胃蛋白酶RI(红色)和SEC-MALS(90°)(橙色)检测器的信号。

表3。分子量的胃蛋白酶通过传统的校准和测量光散射。

	mal	列校准
峰RV - (ml)	18.33	18.63
(Mn) - kDa	34.6	38.秒
(Mw) - kDa	34.7	39.6
Mw /锰	1.004	1.028

SEC-MALS正确测量胃蛋白酶在35 kDa的分子量,但列校准错误在40 kDa测定蛋白质的分子量。这个错误的测量列校准是由于non-globular胃蛋白酶的结构,如果大的值要比球状蛋白质。相反,光散射测量提供准确的分子量是独立于保留体积。

结论

结果清楚地演示的能力莫尔文Panalytical SEC-MALS 20系统提供准确测量分子量的蛋白质。

这些信息已经采购,审核并改编自莫尔文Panalytical提供的材料。亚博网站下载

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