使用CG-MALS的多价抗原和二价结合伙伴的异质关联中的元元素形成

对于宏观分子相互作用（例如SPR和ELISA）的标准分析方法，需要结合伴侣，以固定在表面上以定量结合亲和力。平衡解离常数（K_d）测量并不受到简单1：1关联以及一些1：N相互作用的物理束缚的影响。

但是，如果两个结合伴侣都是多价，则固定一个配体可能会导致通过质量传输限制，表面的伴随效应以及关于相互作用的石学测定法引起的数量级的结合亲和力的错误测量。

然而，组成梯度多角度散射（CG-MALS）完全在溶液中执行相互作用测量，从而使前瞻性结合化的化学仪进行进行，并促进对元复杂形成，自我和异性互动的定量，以及其他多价相互作用。

本文讨论了由抗蛋白天蛋白抗体（AB）与同二酯链霉亲素（SA）结合而产生的复杂石化的分析。

试剂和仪器

CG-MALS实验程序涉及链霉亲和蛋白酶（Sigma-Aldrich）和抗链霉亲蛋白抗体（AMGEN）稀释至磷酸盐缓冲盐中10 µg/ml的库存浓度（PBS; 25 mm NAH）₂po₄，25毫米Na₂HPO₄，50毫米NaCl，200 ppm nan₃pH 6.7）每个实验总计约100 µg。然后，使用Anotop注射器过滤器（Whatman）将每种溶液过滤为0.02 µm。

然后，从Wyatt Technology喂入所得的解决方案进入Calypso II组成梯度系统。该系统准备并提供了各种蛋白质成分，并配备了Wyatt Dawn Heleos Mals检测器和内联紫外线/VIS探测器（水），如图1所示。

用聚碳酸酯（Millipore）滤膜安装CALYPSO，用于样品和缓冲液过滤，孔径为0.1 µm。CALYPSO软件用于执行数据收集和平衡关联常数分析。

图1。Calypso系统硬件设置具有内联紫外线/VIS浓度检测器和黎明HEEOS MALS探测器。

结果

异质关联梯度区域中的光散射信号的增加显示，SA和AB与分子量高于简单1：1或2：1的分子量的结合，如图2所示。这些蛋白质在这些条件下是不可能的，两个结合伴侣的多价性质必须是高阶化学计量法的原因。

图2。SA和AB之间相互作用的光散射和浓度数据。该关联大于1：2相互作用（大胆点红线）可以解释的。

在“跨界”异质缔合梯度中，具有最佳光散射信号的组成（重量平均摩尔质量，m_w）发生在互动的整体化学计量比率下。该比率与M的大小相结合_w生成相互作用的绝对化学计量。测得的M的比较_w图3中说明了三个简单的SA：Ab stoichiomerties。

图3。测量m_w与模拟的M相比_w对于指示的岩石色计量法，在每个结合位点具有KD = 0.2 nm。

峰在M中的位置_w测得的表明，与N：2N（固体紫色线）或2N：N（虚线绿线）相比，最大的复合物形成了N：N（虚线）的化学计量比（虚线）。每个模型的每个结合位点的亲和力都被认为是恒定（KD = 0.2 nm）。

虽然测量的数据达到接近1：1摩尔比的最佳值，但最大值M_w与1：1模型的最大分子量（〜200 kDa）相比，（〜350 kDa）要大得多。

考虑每个SA分子两个AB结合的模拟达到正确的最大MW（〜330 kDa；图3，纯紫色线）。然而，与测量数据相比，该最佳值发生在错误的组成下。该模拟模型大大低估了所有包含过量SA的组合物的测得的MW。

总而言之，这些数据表明，总体化学计量比为1：1，即（sa）的高阶复合物的存在₂（AB）₂，（SA）₃（AB）₃等等。这可能是一个令人惊讶的结果，因为与AB上的两个相比，四个可能的绑定位点SA表明可以使用较高的SA：AB比率进行复合物，如图4所示。

图4。量化链霉亲和蛋白抗体之间相互作用的组成梯度方法。

饱和大多数结合位点的复合物的总体化学计量比为2（sa）：1（ab）。考虑了两个不同的模型来表征SA-AB相互作用：[（sa）（ab）]基本单元的无限自我关联到N：N：N：N：N：N复合物中，以及包括N+1：N和N的更精致分析：N+1配合物除N：N配合物外。

第一次通过分析：1：1的无限自我关联（ISA）[（SA）（AB）]_n

根据该模型，AB用亲和力KD = 22 nm结合SA，而[（SA）（AB）]基本单元与Kd = 50 nm自组装。一个代表两种结合链霉亲和素分子（SA）（AB）的抗体的额外术语₂需要完全捕获光散射中的变化作为组成的函数。[（sa）（AB）]明显浓度很明显_n在这些条件下，n> 3无法获得复合物，如图5所示。

图5。使用ISA模型的CG-MALS杂种数据的最佳拟合。顶部：用于测量的光散射数据（蓝色填充圆圈）的最佳拟合（红色未圆圈）包括（SA）（AB），（SA）（AB）的贡献₂和ISA物种。紫色正方形为所有具有化学计量的物种提供了对模型的总体贡献[（SA）（AB）]_n与n> 1。底部：对于每个组成，可以计算溶液中物种的摩尔分布。在这两个图中，SA和AB单体的贡献都被保留为清晰。

精制分析：包含所有（SA）_我（AB）J，对于我，J <3

尽管为数据提供了适当的拟合度，但ISA模型表明，如果SA分子已经连接到另一个AB，则AB结合SA具有较低的亲和力。空间障碍可以解释这种对复杂形成的较低亲和力。更全面的分析结合了N+1：N和N：N+L复合物以及N：N复合物。

在此分析中，（SA）（AB）₂，（SA）₂（AB）和（SA）₃（AB）₂如图6所示，对总的光散射有显着贡献。₂（AB）₃和（sa）₂（AB）₄，脱落对整体光散射信号有任何贡献。这意味着将AB结合位点与SA饱和而不是具有AB的SA结合位点更为首选。

图6。假设任意（SA）的CG-MALS杂核数据的最佳拟合_我（AB）_j石化的图表。左：最佳拟合（红色未充实的圆圈）与测得的光散射数据（蓝色填充圆圈）是由指定的石化图的组合组成的。右：物种在异质关联梯度中的分布。n> 3包括所有石化的图表[（SA）（AB）]_n与n> 3。在这两个图中，SA和AB单体的贡献都被保留为清晰。

该分析导致k_d每个结合位点狭窄范围为23±4 nm的值。每个结合位点的恒定亲和力表明，如ISA模型所假设的那样，没有影响元素形成的负合作。此外，与ISA模型相比，这种精制模型的残差更加细微，更随机，如图7所示。

图7。第二个“精制”模型（蓝色钻石）的残差比第一个“仅ISA”模型（红色正方形）的残差更小，更随机，表明数据的拟合度更高。

结论

结果表明，CG-MAL能够分析通过多价结合伙伴在解决结合亲和力和绝对石化的数据方面通过多价结合伙伴的形成。通过执行此分析，CG-MALS证明了其在溶液中研究大分子复杂系统的能力。

此信息已从Wyatt Technology提供的材料中采购，审查和改编。亚博网站下载

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