Optilab UT-REX差分折射仪技术，用于超高效液相色谱法

分析高效液相色谱(HPLC)广泛应用于分析化学领域，用于鉴定和定量样品中存在的分子物种。超高效液相色谱(UHPLC)的概念和应用与高效液相色谱相似，但比高效液相色谱有更小的色谱珠和色谱柱。为了了解在线UHPLC dRI检测器的需求，怀亚特技术公司于2013年2月推出了Optilab UT-rEX。

UT-rEX满足UHPLC的要求，因为显著最小化的频带拓宽-保持UHPLC的窄峰宽度质量，以及更高的数据速率，以拥抱高流速和窄峰的独特组合。

此外，UT-rEX包括与T-rEX相同的光电二极管阵列技术和温度调节。本文介绍了几种基于UT-rEX dRI检测的UHPLC分析方法。

蛋白质片段或杂质

牛血清白蛋白（BSA），用于校准蛋白质定量和浓度测量的典型试剂，通常含有97-98％的单体含量和一定量的蛋白质材料，其中大部分是BSA的不可逆聚集体，如调光器和三聚体．

使用UHPLC的高分辨率分离在Sigma-Aldrich BSA中提供了一种新的特征，比主要单体晚在的小峰，如图1所示。

新峰在UV和UT-rEX dRI色谱中均可见。然而，仅通过紫外或RI检测是不可能区分任何可能的小峰源的。

但新峰的UV:RI比单体的高60-70%，表明新物种比单体含有更多的UV活性物质。这反过来表明，新物种不能是错误折叠的牛血清白蛋白或集合体，而必须是杂质或碎片。

图1所示。用UHPLC在牛血清白蛋白中检测到少量杂质或碎片，用300 mm尺寸的排样柱和UV + UT-rEX RI。不同的UV:RI比的片段相对于单体和二聚体表明不同的初级组成。

同分异构体

除非异构体在形状上有很大差异，否则可能无法通过标准的高效液相色谱尺寸排除色谱(SEC)或使用短柱(150毫米)的UHPLC SEC来区分异构体。另一方面，安装一个长柱(300毫米)显著提高了UHPLC分离，从而能够分辨出明显不同的异构体，如图2所示。

图2。IgG、UV + UT-rEX RI的UHPLC-SEC色谱分析。顶部：短，150 mm列显示单体和二聚体，但没有更多。顶部:短，150毫米柱显示单体和二聚体，仅此而已。底:长，300毫米柱解决附加种。常见的UV:RI比值表明所有物种的一级序列大致相同，因此新的峰可能是单体和二聚体的同分异构体。

如图2所示，单体和二聚体的后缘均可见分化峰。当比较UV:RI比值来确定这些物质的组成时，所有峰的UV:RI比值都是相同的，说明其中一对是单体异构体，另一对是二聚体异构体。

通用检测和柱校准

当与其他检测技术相比，折射率检测是相对通用的和几乎通用的，只要使用一个等ocratic方法。将峰值区域结合起来以识别探测器的响应。dRI可以处理许多不同的样品，包括油，合成聚合物，小分子药物化合物，脂类，寡核苷酸，碳水化合物和蛋白质。

借助于UT-REX和反相UHPLC柱的组合分离糖的分离图3.用UT-rex的UHPLC尺寸排除柱的校准在图4中描绘，在整个摩尔质量范围内显示出良好的校准线性。

图3。在UHPLC柱上的糖分离，由UT-rex检测到。

图4。UT-REX用蛋白质标准校准柱子。校准曲线是高度线性的。

峰面积线性

测试线性度的一种标准方法是注入由各种总质量组成的等量链，按干重测量。结合峰值区域来识别探测器的响应。

图5示出了由UT-REX反对注入质量确定的峰面积的未结线性响应的绘图。这种线性在±4.7×10-3 rIU的整个动态范围内是一致的，其对应于〜35mg / ml碳水化合物或25mg / ml蛋白质。这确保了通过任何分析色谱法，探测器响应不会饱和，以便在包括最准备的色谱法中分离。

图5。UT-REX的线性定量响应。探测器在非常宽的范围内线性，最高可达约25mg / ml蛋白质。

UV-Inactive杂质检测

集成紫外检测器的分析UHPLC-SEC通常用于紫外活性物质(如蛋白质)的质量控制。然而，样品中的污染物可能并不总是具有发色团，最终会不被注意地通过。在这种情况下，掺假的样品将通过QC测试。

三种蛋白样品:纯IgG(红色)和被两种代表性杂质(10 kDa右旋糖酐(蓝色)和40 kDa右旋糖酐(绿色)污染的IgG样品的联合UV-RI分析如图6所示。图6a显示了覆盖的UV轨迹，图6b显示了覆盖的RI轨迹。通过两幅图的比较，说明了如何通过双重检测将杂质与蛋白质区分开来。

图6。在蛋白质分析中发现杂质。流动相为磷酸盐缓冲盐水。绿色:纯免疫球蛋白;蓝色:IgG + 10kda右旋糖酐;试剂:IgG + 40 kDa右旋糖酐。上图:紫外检测。下:UT-rEX探测dRI。

样品的溶剂梯度检测

溶剂梯度通常与流动相的折射率的剧烈变化有关，压倒性和饱和大部分在线差分折射率检测器。

UT-rex也有益于Optilab T-rex的相同扩展动态范围，使其能够适应这些大变化，同时保持灵敏度，即使溶剂梯度允许小样本峰值检测。

图7展示了梯度色谱与dRI检测，利用Optilab rEX技术在标准HPLC系统上的扩展范围。虽然折射率在整个色谱中变化很大，UT-rEX dRI检测能够清楚地捕捉洗脱溶菌酶峰，并从初级物种中分辨出变体或杂质。

图7。反相乙腈/水梯度，10%→90%，dRI分析。样品是溶菌酶。上图:250 μg溶菌酶注射后的原始数据，在急剧变化的RI信号上显示为一个小特征。下:基线减去后，这一次是从25 μg溶菌酶注射(在梯度基线上几乎看不见)。早期洗脱，小峰未鉴定。

结论

Optilab UT-REX是通用检测器，使独立操作能够作为UHPLC柱下游的鞋底在线检测器，或者可以与另一种检测器一起使用，例如UV / VIS吸收。上述基础UHPLC清楚地证明了这一创新探测器的能力。

UT-rEX与任何供应商的UHPLC系统兼容，尤其适用于脆弱的生物分子，因为它允许在实验室标准室温下的温度低于环境温度4°C。在任何使用超高效液相色谱技术的分析实验室中，它都是一个有价值的工具。

这些信息已经从Wyatt Technology提供的材料中获得、审查和改编。亚博网站下载

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