豆类是一个关键的蛋白质供应商，特别是在发展中国家。因此，提高豆类种植的效率将增加这些国家的食品供应。
与图1中所示的生物结节中的共生细菌对于豆类的生长至关重要。
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图1。豆科植物（a）经常在其根部（b）中展示所谓的结节（b），其中根根亚细菌属于并生活在与植物的患者关系中。
根瘤菌细菌与根细胞保持内卵生物关系。相关光和电子显微镜（CLEM）该技术充分利用了荧光显微镜(FLM)和扫描电子显微镜(SEM)的优点，有助于更好地了解豆科植物的根瘤菌对寄主的侵染和定殖。
FLM概述了细菌对细胞感染状态的概述，而SEM图像揭示了亚体蛋白细菌的细胞内分布和关系。可以看到膜可以看出，可以看到较高的分辨率，因此可以看到这些细菌的组织封闭的子平整蛋白或SymbioSomes中的细菌。
因此，在根结节组织的上下文中可以在不同细胞上用克隆进行统计分析。这一原因使CLEM成为在系统生物方法中收集相关数据的基本工具。
样品制备
样品制备涉及通过高压冷冻接种的绿豆植物的根结节的固定，然后通过高压冷冻，然后在液氮中储存直至进一步加工。
然后freeze-substitution进行四氧化锇与2%醋酸铀酰丙酮和1% (28 h在-90°C, 8 h在-60°C和h在-35°C)。醋酸双氧铀和四氧化锇固定液保持超微结构和利用样品中脂质成分,同时担任重金属污渍改善扫描电镜对比。
用丙酮和乙醇洗涤后，用HM20（多电解）在乙醇中用HM20（多电解）浸润，用于嵌入，然后在新鲜纯HM20中聚合UV聚合。亚博老虎机网登录一旦树脂固化，将样品切成70nm超薄部分，利用配备有金刚石刀（Diatom族）的超微摩托。
然后将该部分转移到涂有ITO的盖子滑块上。然后使用DAPI染色部分以允许FLM成像。然后将该部分与乙酸铀酰后染色并柠檬酸盐进行SEM成像。
成像
将盖板放入样品架，该样品架由Carl Zeiss为Clem设计。可以在LM和SEM中使用该支架，在整个成像过程中牢固地固定在保持器中的样品。持有者具有三个基准标记，可在此方面实现非常快速和半自动校准班车和查找AxioVision软件的模块。
这些部分的FLM与来自Carl Zeiss的Axio Imager.m1，利用40倍物镜，例如EC计划 - 新扫描器40x / 0.75 M27和365nm励磁的过滤器组和445/50nm发射（过滤器组49）。从Carl Zeiss的Axiocam MRM配有显微镜，然后设定为成像1000 ms的曝光时间。在定义和选择荧光图像中的感兴趣区域（ROI）之后，将样品从Carl Zeiss转移到Gemini 1530 Fe-Sem。在完成半自动校准和随后的样品架的微量校准后，在FLM中成像的ROI立即以小于5μm的精度转移。然后，使用透镜中的二次电子检测器以2kV加速电压进行SEM成像。
结果
图2显示了根结节区域超薄切片的宽场FLM图像。细菌表现出DAPI荧光，细胞壁的荧光信号是由于自身荧光。因此，有可能识别特定的根细胞感染的细菌和分析细胞组装。
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图2。Mung Bean根结节的70 nm截面的FLM图像显示有和没有细菌感染的细胞;ROI由帧表示。
所选的ROI如图3所示。在共生体中可以清楚地观察到细菌的结构、胞内组织和方向。
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图3。FLM（A;放大）和SEM（B）图中选择的ROI图像。可以清楚地识别细菌群（P），细胞核（N）和真空（V）。
此外，可以在FLM和SEM图像的比较中精确地分配其他细胞化合物。另外，SEM图像的高信噪比使得特定结构的分割，因此允许半自动地收集统计数据。
结论
这班车和查找克隆的界面促进了豆类根瘤细胞的细菌感染分析快速且可靠地。由于在两个显微镜系统中识别相同的ROI的过程，该界面显着加速了工作流程。因此，可以在合理的时间内执行串行部分成像，从而能够改变生物系统的3D组织。此外，该解决方案为新的可能性铺平了新的可能性，特别是对于微观图像中的统计数据分析，现在可以系统地进行。
此信息已采购，从Carl Zeiss Microscopy GmbH提供的材料进行审核和调整。亚博网站下载
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