氯霉素是1949年首次使用的一种通用抗生素，作为人类的一线治疗药物，由于其潜在的有害相互作用和影响，如抑制骨髓，导致非再生性贫血或可能致死性特发性再生障碍性贫血等，氯霉素的使用受到限制。
此外，氯霉素是潜在的非竞争性微观组织酶抑制剂能够影响其他药物的代谢。它也用于兽医应用，但由于人类有害影响的可能性，而不是食物动物。
根据欧洲联盟决定2003/181 / EC，严格禁止牛奶中氯霉素存在的任何水平，所有氯霉素检测技术都必须满足或超越0.3 ppb的最小所需性能水平（MRPL）。一种液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）已经产生了多重反应监测（MRM）模式的技术用于检测乳基质中的氯霉素存在的痕量水平，具有最小的样品制备。实验涉及使用三个MRM过渡，其中两个用于资格和一个用于量化。氯霉素的定量限制设定为0.02ppb，具有均匀的鉴定离子的比例。在牛奶基质中指向0.02和1.0 ppb的校准曲线是线性的r2= 0.9980(权重:1/X)。
实验
样品制备
该实验在剑桥同位素实验室和氯霉素（98％）的氯霉素-D5（乙腈中100μg/ ml）含有Sigma-Aldrich。根据Cronly等技术的技术制备空白乳基质。将一个mL乙腈和0.5g全牛奶混合并在2ml离心管中涡旋30 s，然后加入并振动0.25g NaCl 30 s。将浆料以12000rpm的速度离心10分钟。然后将所得的顶部有机层移入离心管，并通过在45℃下蒸发在Eppendorf真空浓缩器上干燥。将所得提取物的重构在0.5mL初始流动相（90:10水：MeOH）中进行，然后使用0.2μMPVDF注射器过滤器过滤。将不同量的盖子与0.3ppb（以基质）D5帽作为内标一起掺入乳基质的等分试样中。
色谱法(推进高效液相色谱法)
- 柱：ACE C18，50x2.1mm，3μ
- 流动相A:水
- 流动相B:甲醇
- 注射体积：10μL
- 流量:0.5毫升/分钟
- 梯度条件
- 0.00分钟10％b
- 0.05 min 10% B
- 2.50分钟95％b
- 3.00分钟95％b
- 3.10 min 10% B
- 4.50 min 10% B
质谱（EVOQ QUBE）
- VIP加热ESI温度：400°C
- 锥气温度:350°C
- 加热探针气体：80个单位
- 喷雾器气体:80个
- 锥气：10个单位
- 喷雾电压：-4500 V.
- 标准分辨率
- 主动排气：上
- MRM扫描时间：100ms / MRM
- CAP＆D5帽MRM过渡
- M / Z 320.9> 152（CE：12V）定量
- M / Z 320.9> 257（CE：8V）资格认证
- M / Z 320.9> 194（CE：10V）资格认证
- m/z 326>157 (CE:12v
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图1所示。Bruker Evoq.
结果和讨论
图2显示了最低峰值水平0.02 ppb(柱上200 fg) CAP和牛奶基质空白的重叠色谱图。在矩阵空白中检测到微弱的背景信号。另一方面，与最低峰值水平相比，矩阵干扰峰的强度非常低，可以检测到0.02 ppb的CAP。
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图2。在牛奶基体和基质空白中添加0.02 ppb的CAP叠加色谱图(TIC为3 MRMs)。
图3展示了帽的所有三个MRM的重叠色谱图，以及峰 - 峰（PP）信噪比（S / N）。在基质中，所有S / N（PP）比率大于10.020ppb帽（柱上柱）。
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图3。覆盖MRM色谱图的牛奶基质坯料（绿色）和0.02ppb帽掺入牛奶基质（红色）。
资格
第2002/657/EC号决议指出了验证所需化合物检测的各种参数。氯霉素是a类违禁物质，至少需要4个识别点(IP)。这可以通过至少2个MRM来满足，每个MRM产品离子分配1.5个IP，前体离子分配1.0个IP。在规定的公差下，每个MRM的离子比必须与认证的标准物质的离子比相匹配。对于离子比在最强烈转变的20%到50%之间的合格mrm，最佳允许公差为±25%。
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图4。MRM色谱图0.05ppb帽（柱上柱上的0.5pg），具有离子比率及其RSD（n = 3）
在该分析中，离子比值在0.05和1ppb水平之间是稳定的(<10% RSD)，如图4中0.05 ppb的例子所示。然而，如图3所示，由于基质对定量MRM(320.9>152)的贡献，0.02 ppb水平的离子比值超出了范围。然而，用基质空白校正后，离子比稳定在15%以内。
定量
图5显示了6级矩阵的产生，校准曲线在0.020和1.0ppb之间，每个级别一式三份分析。r = 0.9980（加权因子= 1 / x）更好的线性。
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图5。乳基质中盖帽（320.9> 152）的校准曲线从0.02ppb至1.0 ppb（6级：0.02,0.05,0.10,0.3,0.5,1.0 ppb）。
结论
已经创建了一种简单而快速的LCMS / MS技术，用于使用牛奶矩阵中的漏斗水平EVOQ qube三重四极杆质谱仪。EVOQ Qube可以检测和测量牛奶基质中0.02 ppb CAP的浓度。
这些信息已采购，审查和调整Bruker - Chemical and Applied Markets提供的材料。亚博网站下载
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