2012年4月24日
近年来，毛细管等电聚焦(cIEF)分离技术越来越多地应用于治疗性蛋白的表征。的determination of pI adds a critical dimension to establishing identity, purity, post-translational modification and stability of therapeutic protein preparations. A significant proportion of cIEF analyses being carried out in the biopharmaceutical industry involve characterization of monoclonal antibodies (mAbs). Many mAbs have charge isoforms with a pI in the basic range of the pH gradient.
碱性化合物在cIEF中提供了一个挑战，因为组成碱性区域的两性电解质性质不充分，以及孔pH梯度随时间的衰减。在cIEF样品溶液中加入阴极和阳极稳定剂有助于克服这些障碍。此外，通过优化稳定剂溶液体积、聚焦时间和两性电解质浓度，可以开发出一种适用于整个pH范围的单一方法。该策略支持开发用于产品管道特性描述的单一协议，也称为平台方法。
这一点很重要，因为生物制药行业需要简单和多功能性。这些努力的结果是开发了一种健壮的、便携的分析技术，减少了操作人员错误或系统变异的可能性。
方法
单抗样品的制备
单抗样品的制备方法如下:
- 将500 μL体积的基础治疗单抗(5-10 mg/mL)解冻并装入Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530, Millipore, Billerica, MA)。
- 在Microfuge 18 (p/n 367160, Beckman Coulter, Inc.， Fullerton, CA)中以12 k rcf离心5分钟后，用20 mM Tris缓冲液pH 8.0替换过滤后的体积。
- 再进行两次离心和更换缓冲液循环，将脱盐的样品分成大约50 μg的馏分，并在-20°C或以下保存。
毛细血管和试剂
以下步骤是关于毛细血管和试剂的:
- 一个Beckman Coulter50μmi.d.中性毛细管（P / N 477441）安装在配备有200μm光圈的毛细管盒中。
- 在安装之前，测量毛细管，使其总长度为30.2cm，从入口到检测窗口的长度为20cm，从出口到检测窗口为10cm。
- 用39.5 mL的双去离子水(DDI)稀释550 mL 85% (w/v) (14.6 M)磷酸(Sigma 438081)，制备出含有200 mM磷酸的阳极液，体积为40 mL。
- 将12 mL 1 M氢氧化钠(Sigma p/n 72082)稀释到28 mL DDI水中，制备出含300 mM氢氧化钠的阴极溶液，体积为40 mL。
- 将0.8 mL的冰醋酸(99.8%)，17.4 M (Sigma p/n 537020)稀释到39 mL的DDI水中，制备出含有350 mM醋酸的化学调动剂溶液，体积为40 mL。
表1。掌握制备混合。通过混合适当的组分体积，得到了cIEF主混合溶液。这些体积包括超过20%的体积，以解释移液误差。混合组分中含有12 μL Pharmalyte* 3-10 (GE Healthcare p/n 17- 0556 -01)、20 μL 500 mM l -精氨酸、2 μL 200 mM IDA、1.0 μL 1.25 mM肽pI标记物和200 μL 3 M ureacIEF凝胶。
| 试剂 |
单样本体积μL |
|
3样品主混合体积μL |
| 3 m Urea-cIEF凝胶 |
200 |
x3.2 |
640. |
| Pharmalyte 3-10载体两性电解质 |
12 |
x3.2 |
38.4 |
| 500毫米精氨酸阴极稳定剂 |
20. |
x3.2 |
64 |
| 200毫米IDA阳极稳定器 |
2 |
x3.2 |
6．4 |
| 合成肽PL 10标记 |
1 |
x3.2 |
3.2 |
| 合成肽PL 7.0标记 |
1 |
x3.2 |
3.2 |
应用程序信息
下面列出了获得毛细清洁解决方案的步骤：
- 将10.8 g尿素(Sigma p/n U0631)溶解在30 mL DDI水中，制成毛细管清洗液。
- 将毛细管清洗液混合，直到所有固体溶解，然后通过Acrodisc* 25毫米带5 μm孔的注射器过滤器(Pall p/n 4199)过滤，以去除颗粒。yabo214
- 3 M urea-cIEF凝胶的解决方案是由溶解尿素的1.80 g(σp / n U1250) 9毫升cIEF凝胶(p / n 477497),混合15分钟和加载到30毫升注射器(Becton迪金森p / n 309650)然后过滤使用5 -μM孔隙Acrodisc 25毫米注射器过滤器(4199年笼罩p / n)去除粒子。yabo214
- 用Allegra x15r离心机(Beckman Coulter p/n 392933)在2000 rcf下脱气3 M尿素- cief凝胶溶液，并在2-8℃下保存。
- 阴极稳定器的解决方案包括500毫米Larginine是作为一个50毫升大部分首先溶解4.36 g精氨酸(98%)(σp / n A5006)固体35毫升的DDI水50毫升容量瓶,然后容量瓶动摇了15分钟溶解,最后增加体积和DDI 50毫升的水。
- 首先将1.33 g亚氨基二乙酸(98%)(Sigma p/n 220000)固体与35 mL DDI水溶解在50 mL容量瓶中，制成含有200 mM亚氨基二乙酸(IDA)的阳极稳定溶液，体积为50 mL。
- 将混合物摇动15分钟以溶解所有固体，并且使用DDI水将体积升至50mL。
- 用6 mL DDI水稀释4 mL pH 8.0 (p/n 477427)的50 mM Tris缓冲液，制成含有20 mM Tris的单抗缓冲液替代溶液。
表2。样品制备。将240 μL的主混合混合后，将其加入到一个包含全部脱盐单克隆抗体的试管中。将完整的样品溶液旋涡，将200 μL转移到PCR管中，滴上矿物油(Sigma p/n 8410-5ML)，放入样品瓶中。
|
10 mg / ml mAb |
5毫克/毫升马伯 |
| 掌握混合 |
240 |
240 |
| 脱盐马伯 |
5 |
10 |
仪器配置
仪器的配置如下:
- 的贝克曼库尔特PA 800蛋白表征系统配备UV检测器和280nm过滤器，带通+/- 10nm的带通。
- 检测器设置为以2hz的采集速率检测直接吸光度。
- 电子滤波器设置在正常设置，峰值宽度设置为16至25。
- 在20℃的毛细管温度设定下进行所有分离。系统自动采样器设置为10°C的温度。
调理方法
以下是调节过程:
- 在初始安装毛细管盒之后，通过首先通过将毛细血管的入口浸没在含有1.8ml DDI水的玻璃瓶中并从入口侧施加50psi的压力2分钟来通过首先进行水冲洗来调节中性毛细血管。
- 延长水冲洗之后是弱酸冲洗，将毛细管入口浸入装有1.8 mL化学激发剂的小瓶中，并从入口侧施加50 psi压力2分钟。
- 最后通过将毛细血管的入口浸没在含有1.8ml Beckman Coulter沉淀凝胶的小瓶中并从入口侧施加50psi 5分钟来进行调理冲洗。
平台割礼分离方法
平台骗取
单抗样品采用以下分离方法分离:
- 首先将毛细管的入口浸入装有1.8 mL毛细管清洗液的小瓶中，并从入口一侧施加50 psi的压力3分钟来清洗毛细管。
- 在毛细管清洗液冲洗步骤之后，用水冲洗毛细管，将毛细管的入口浸入装有1.8 mL DDI水的小瓶中，并从入口侧施加50 psi的压力2分钟。
- mAb CIEF样品溶液通过从毛细管入口侧施加25 psi压力99.9秒引入毛细管。
- 在清洗、水冲洗和样品加载步骤中，毛细管的出口侧被放入一个废弃的小瓶中。
- 样品后，梯度通过将毛细血管的入口侧浸没到含有1.8ml阳极电解液的小瓶中的小瓶中的小瓶中，进入含有1.8ml阴极电解液的小瓶中并在毛细管上施加25kV电位15分钟。
- 聚焦峰在化学上调动，在此期间将阴极电解液溶液用含有1.8ml化学动员的小瓶替换，并在毛细管上施加30kV电位20分钟。
- 在完成动员步骤之后，通过将毛细血管的入口浸没在含有1.8ml DDI水的小瓶中并从入口侧施加50psi，通过将50psi从入口侧施加50psi，从入口侧施加50psi，进行水冲洗步骤。
关闭方法
关闭方法涉及以下内容：
- 将仪器关闭，毛细管在工作日结束时使用的关闭方法在工作日的末端存储在毛细血管中，通过将毛细管的入口浸入含有1.8ml DDI水的小瓶中并施加50psi来自入口侧的压力2分钟。
- 水冲洗后，将毛细管入口浸入装有1.8 mL贝克曼库尔特cIEF凝胶的小瓶中，并从入口侧施加50 psi压力10分钟进行调节冲洗。
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图1所示。初始条件。图片来源:Beckman Coulter
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图2。探测器的设置。图片来源:Beckman Coulter
缓冲盘设置
在分离之前，将装有1.6 mL cIEF分离试剂的玻璃瓶按图3所示的顺序放置在缓冲托盘中。毛细管清洗溶液的缩写是“Cap Clean Sol.”，化学助剂是“Chem.”。暴徒。”箭头表示碱性pH梯度cIEF分离法增加的试剂和增加的方向。
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图3。缓冲盘设置。图片来源:Beckman Coulter
结果
pH梯度范围和线性度
两性电解质缓冲pH的有效分离范围和线性度是cIEF中必不可少的因素。使用基本pH范围法对pH范围为4.1至10的pI点合成肽标记物进行cIEF分离(表3)，以评估线性。此分离(图4)表明，该方法功能范围广，在动员时间延长的情况下，甚至可以对酸性肽标记物进行分离。
表3。pI标记检测次数。图4包含pI点、氨基酸序列和pI标记分离的检测次数。
| π标记 |
氨基酸序列 |
动员时间最小值 |
| 10．0 |
H-Trp-Tyr-Lys-Lys-OH |
22.408 |
| 9．5 |
H-TRP-TYR-TYR-LYS-LYS-OH |
23.462 |
| 8．4 |
H-TRP-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys-OH |
27.375 |
| 7．0 |
H-TRP-GLU-HIS-ARG-OH |
29.429 |
| 6．7 |
H-TRP-GLU-HIS-ARG-OH |
29.892 |
| 5．5 |
H-Trp-Glu-His-OH |
32.808 |
| 4.1 |
H-Trp-Asp-Asp-Arg-OH |
36.683 |
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图4。合成肽pI标记物的cIEF分离。它包含了使用基本pH梯度cIEF分离方法的七个合成肽标记物的电泳图。将动员步骤从35分钟延长到40分钟，以实现pI 4.1标记物的检测。图片来源:Beckman Coulter
对合成肽标记物的pI与检测时间的分析(图5)表明，pH值在10和4.1之间呈线性关系，相关系数为0.99。高度碱性的蛋白质种类如果没有适当的集中，有时会被误认为是盐锋。如图4所示为阴极预峰。
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图5。pI标记线性模型。pI值与检测时间的关系图如表1所示。pI标记物的动员符合线性模型，相关系数为0.99，表明动员pH梯度呈高度线性。图片来源:Beckman Coulter
三株单克隆抗体的分离
MAbs倾向于在凹凸分开时产生复杂的电荷同种型曲线。除了峰值的实际PI值之外，这些配置文件会产生“MAB”指纹。正是由于这个原因，CIEF可以是识别和表征单独的MAB准备的强大工具。不同MAB的独特峰谱表明，使用宽pH3至10Ampholyte混合物的单个方法能够在梯度的基本范围内将PI的PI差异高达几百百分点1PH单位（图6）。
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图6。三种单克隆抗体的cIEF分离。cIEF在相同条件下分离的三种基本单克隆抗体的电泳图如图4所示。图片来源:Beckman Coulter
单克隆抗体分离的重复性
为了检验该方法的中间精密度，一组三种抗体在两个仪器上使用两个不同批次的中性毛细管和试剂在6天内分离。所有数据采用32karattm软件进行整合。通过定性分析工具，以pI 10和7个合成肽标记物的检测次数确定pI。每个单克隆抗体的峰被分为三个亚型，碱性，主酸性，并计算每个亚型的百分比组成(图7-9)。记录三种单克隆抗体的七个特征峰的pI点和三个亚型组的百分比组成。这些记录的值被用来计算百分比变异系数(%CV)，用来衡量分析的重复性。
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图7。mAb(1)峰廓线。mAb #1 cIEF分离的近距离观察。图片来源:Beckman Coulter
表4。单克隆抗体1号cIEF分离的定量分析。定量分析采用七个特征峰的pI点和三个异构体组的百分比组成。
n = 25.
计算p1 |
| 山峰 |
平均 |
性病Dev |
简历 |
| 一个 |
9.65 |
０．０１ |
0.05% |
| B |
9.58 |
０．０１ |
0.06% |
| C |
9.48 |
０．０１ |
0.07％ |
| D |
9.44 |
０．０１ |
0.09% |
| E |
9.33 |
０．０１ |
0.08% |
| F |
9．27 |
０．０１ |
0.07％ |
| G |
9.24 |
０．０１ |
高达 |
| 同种型组成百分比组成 |
| 集团 |
平均 |
性病Dev |
简历 |
| 基本 |
13.94% |
0.42% |
3.04% |
| 主要 |
71.97％ |
0.46% |
0.64% |
| 酸性 |
14.09% |
0.34% |
2.38% |
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图8。mAb #2峰值轮廓。mAb #2 cIEF分离的近距离观察。图片来源:Beckman Coulter
表5所示。mAb #2的定量分析。定量分析采用与mAb #1相同的方法。
n = 25.
计算p1 |
| 山峰 |
平均 |
性病Dev |
简历 |
| 一个 |
8.31 |
0．00 |
0.06% |
| B |
8.18 |
０．０１ |
0.07％ |
| C |
8.13 |
０．０１ |
0.07％ |
| D |
8.07 |
０．０１ |
0.07％ |
| E |
8.01 |
０．０１ |
0.07％ |
| F |
7.90 |
０．０１ |
0.07％ |
| G |
7.78 |
0．00 |
0.05% |
| 同种型组成百分比组成 |
| 集团 |
平均 |
性病Dev |
简历 |
| 基本 |
30.97% |
0.67% |
2.17% |
| 主要 |
45.01％ |
0.45% |
0.99％ |
| 酸性 |
24.02％ |
0.60％ |
2.50% |
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图9。mAb #3峰值轮廓。mAb #3 cIEF分离的近距离视图。图片来源:Beckman Coulter
表6所示。mAb #3的定量分析。定量分析采用与mAb #1相同的方法。
n = 25.
计算p1 |
| 山峰 |
平均 |
性病Dev |
简历 |
| 一个 |
7.79 |
0．00 |
0.06% |
| B |
7.59 |
0．00 |
0.05% |
| C |
7.46 |
0．00 |
0.06% |
| D |
7.43 |
0．00 |
0.04％ |
| E |
7.38 |
0．00 |
0.05% |
| F |
7.28 |
０．０１ |
0.07％ |
| G |
7.12 |
0．00 |
0.06% |
| 同种型组成百分比组成 |
| 集团 |
平均 |
性病Dev |
简历 |
| 基本 |
18.03％ |
0.28％ |
1.53% |
| 主要 |
68.42% |
0.42% |
0.62% |
| 酸性 |
13.55％ |
0.34% |
2.49% |
结论
单一的分离方法可以在较宽的pH范围内对多个单克隆抗体进行cIEF分析。使用单一的方法可以制备主分离混合物，这有助于减少移液误差和样品间的可变性。采用平台方法简化了工作流程，减少了操作失误的机会，提高了方法开发的整体效率。cIEF分离技术的分析能力由每个单克隆抗体分离中产生的三个非常不同的峰廓说明。通过使用多种仪器和多种试剂在6天内进行一系列分离，证明了该分离方法的重复性。pI和异构体组百分比组成的统计分析证实，单克隆抗体的cIEF分离即使在之前有问题的pH梯度的基本区域也可以实现。
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这些信息已经从贝克曼库尔特公司提供的材料中获得，审查和改编。亚博网站下载
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