使用多学器4 Coulter计数器的蛋白质表征

写道氮杂2012年4月20日

Beckman Coulter的MultiSizer 4提供了一种用户友好的技术复杂的系统，可以解决大多数计数和粒子尺寸挑战。多学器4利用智能技术利用Coulter原理，确保样品分析的均匀性，一致性和结果的可重复性。当在低浓度下表征非常小的颗粒时，清洁程序是有价值的。yabo214本文讨论了分析程序的详细信息。

物料需求

的Nalgene 5毫升样品瓶（费希尔P / N 6250-0005）。
舞台适配器(贝克曼库尔特P/N A93166)。
中性清洁剂(贝克曼库尔特P/N 8304096)。
推荐孔径：30μm，50μm，70μm或100μm。
内部孔径刷（Beckman Coulter公司P / N 54060001）。
外部光圈刷（Beckman Coulter公司P / N 5406011）。
Accuvette ST（Beckman Coulter公司P / N A35473）。
200mL的增强性能烧杯（Beckman Coulter公司P / N A35596）。
异丙醇（任选）。
2％肥皂溶液的额外电解质罐（Beckman Coulter P / N A36403）（可选）。
注射器过滤器。
- 颇尔的Acrodisc25毫米PES过滤器。
- 0.45 μm孔隙(Beckman Coulter P/N 4614)。
- 0.20μm孔径（Beckman Coulter公司P / N 4612）。

程序

需要注意的是，所有缓冲区都必须经过高度过滤，以确保精确计数。建议缓冲器先通过0.45 μm滤波器过滤，然后再通过0.2 μm滤波器串行连接。为方便起见，推荐使用PES过滤器进行连续过滤。

仪器启动

在研究的情况下在本文中进行分析，该Multisizer3的4已超过72小时空闲;建议使用中性洗涤剂的2％的溶液重复冲洗。任选地，异丙醇（IPA）都可以使用。任何盐晶体，灰尘或其它污染物被除去，这可能已经在系统中形成，而这是空闲的。

启动程序

Multisizer 4的启动程序包括以下步骤:

选择“RUN”，然后在MULTISIZER 4软件的菜单栏中选择“排水系统”。按照屏幕上的说明进行操作。
在系统排水时，向电解液瓶中注入清洗液(2%的肥皂或IPA)。
更换多化器4中的电解质瓶。
选择“运行”，然后在菜单栏中“填充系统”。
该系统的填充后，重复步骤1-4。重复整个循环三次。
在最后的排水后，用来自连续过滤系统的高度过滤的Isoton II填充系统。

该内部废物箱可以在此过程中变得充满的是要注意非常重要的。在这种情况下，“空废物箱”提示时必须选择。这将泵内部的废物箱中的内容到外部废罐子。

运行样本

基于正在运行的样本系统的类型以及表1中所示的指导方针，需要选择孔径来工作。必须从菜单栏中选中“RUN”，然后必须选择“更改孔径管向导”。需要遵循屏幕上的说明。

表格1。缓冲强度和最低推荐尺寸范围的指南。

孔径	最低推荐电导率(μS/cm)	近似NaCl浓度DI水	推荐阈值下限在此电导率
20 *	15000年	154毫	0.4μm
30 *	15000年	154毫	0.6微米
50	5000	40毫	1.1μm
70	3,750.	30毫米	1.4μm
100.	2750年	20毫米	2.3μm

*不推荐用于低电导率缓冲。

以下步骤如下所示：

安装阶段适配器。因为它将出现在实验开始时的样品台，如图1所示。

图1所示。微型比色皿适配器允许用户操作该Multisizer3的4时的4毫升的材料。图片来源:Beckman Coulter
将一个5ml的Nalgene杯子装满感兴趣的缓冲液。重要的是要注意，为了得到准确的结果，这种缓冲液必须与电解液罐中的缓冲液匹配。
测试在感兴趣的缓冲噪声水平。从菜单栏中，选择“运行” /“故障排除” /“检测噪声水平”。会出现一个弹出框。选择“测量噪声电平”，如图2A和图2B。
图2A。运行/故障处理菜单下“检查噪音级别”命令截图。图片来源:Beckman Coulter
图2B中。“检查噪音等级”命令截图。选择“测量噪音声级”后，结果应符合或超过表1的建议。图片来源:Beckman Coulter
检查SOM (standard operation mode)设置是否按照界面提示进行了设置。选择“编辑SOM”打开SOM菜单。见图3A和3B。
图3A。在“SOM”菜单的截图。选择“编辑SOM”打开SOM菜单。图片来源:Beckman Coulter
图3B中。“编辑SOM”菜单的屏幕截图。使用SOM菜单中的选项卡进行导航。确保所有设置都匹配文本中描述的设置。图片来源:Beckman Coulter
1. 在“控制模式”选项卡下-验证控制模式是否设置为体积。建议每次运行的最大分析容量为100 μl。选择“应用”。
2. 在“运行设置”选项卡 - 确保“包括脉搏数据”被选中。运行数必须是与“第一次运行前冲洗口管” 3.选择“每次运行后冲洗口管”。选择“应用”。
3. 在“搅拌器”选项卡下-检查“样品烧杯”下是否选择了“Accuvette ST”。点击“应用”。
4. 在“当前和增益”标签下，验证大小阈值是否在表1中的最低推荐尺寸或低于最低推荐的尺寸。
5. 在“脉冲大小设置”选项卡下-验证设置在或高于表1中列出的最低推荐尺寸。在菜单栏中选择“SOP”，然后选择“编辑SOM”。选择“脉冲大小设置”选项卡。勾选“from”旁边的值。选择“应用”。
6. 在“集中”选项卡 - 输入（如果适用）稀释信息。
7. 在“堵塞”选项卡下选择“堵塞检测”。选择“默认值”，然后选择“确定”。选择“堵塞监视器…”，“默认”，然后选择“确定”。
完成SOM协议后，仅通过选择“开始”执行缓冲区。仅缓冲器仅在100μL样品中读取少于100个总粒子。yabo214为了验证此项，确保已选择“数据”窗口中的“图表下拉菜单”下拉下的“编号”。然后，检查统计信息框中的粒子计数。有关参考，请参见图4。
图4。缓冲区运行示例的截图。对于100 μl的空白，粒子总数应小于10yabo2140。对空白样品测定100 μl时，“数量”应小于100。图片来源:Beckman Coulter
只运行一次的缓冲完成后，仪器即可运行样品。删除空白，装载样品，并选择“开始”。
在一个块时，按照步骤8“运行完成后”。
运行完成后，降低的阶段。填写烧杯或Accuvette用2％的肥皂溶液和淹没光圈可以在手握住烧杯中，让门开着。在复合定4软件选择“解除阻止”。这将反复冲洗通过孔的肥皂溶液和除去任何蛋白质。这是必要的，因为蛋白质易于附着所有表面。在疏通过程完成后，装入空白样品，关上门，然后选择“预览”。的浓度计应在0.0％稳定。它稳定前，可能需要几秒钟。这是如图5A和图5B来冲洗掉任何残留的样品所需的时间。
图5A。门开着，在孔周围放一个装满2%的肥皂溶液的烧杯。图片来源:Beckman Coulter
图5B。手持有肥皂溶液的烧杯时，在软件中选择“解除阻塞”按钮。图片来源:Beckman Coulter
重复步骤6-8，直到所有样本都完成。

仪器关机隔夜

在一个200ml的烧杯中加入2%的肥皂溶液。把舞台翻过来，以便容纳烧杯。把烧杯放在台上，但不要举起来。
在Multisizer 4软件中，在菜单栏中选择“SOP”。选择“编辑SOM”。在“Sample烧杯”下，选择“200ml ST”。确保选择了“使用搅拌器”箱，搅拌器转速为20。选择“应用”。搅拌器必须移动到多用机4上的位置。
阶段升高与200毫升烧杯中。一旦淹没搅拌器必须开始移动。该系统可与这种设置可以放置过夜。第二天，应遵循的这一程序需要“运行样品”一节。