利用Veeco仪器的BioScope II AFM原子力显微镜检测突变亨廷顿细胞形态的变化

原子力显微镜(AFM)的工作原理是在样品上方扫描一个由灵敏的力传感悬臂支撑的尖头，从而产生表面的三维图像。当尖端扫描样品时，与表面相互作用的变化改变了尖端的垂直偏转。这些挠度的变化是通过光学检测方法监测的。反馈控制系统通过调整尖端样品距离来响应这些变化，以保持恒定的偏转。正是这种尖端的垂直运动被用来产生表面的地形图像。contact mode和TappingMode™在生命科学应用中都显示出了很高的价值，特别是在过去的5年里。亚博老虎机网登录

AFM的高分辨率成像能力，最近促进了超分子组装的原子模型的构建，从光合蛋白和通道蛋白的地形图像。此外，AFM在活细胞成像方面的应用也取得了很大进展。然而，原子力显微镜在生命科学领域最显著的进展之一是在近生理条件下对活细胞进行力谱研究的应用。亚博老虎机网登录

力光谱允许以高空间分辨率和高力灵敏度调查单分子识别过程，细胞动力学和机械性能。最近，AFM力量研究已成功应用于诸如阿尔茨海默氏症和亨廷顿的疾病等神经变性疾病的研究。

将原子力显微镜与光学显微镜相结合

进行原子力显微镜力谱实验本质上是一个统计过程。因此，这些研究通常需要进行许多对照实验，以确信地将观察到的相互作用归因于感兴趣的配体和受体的特定结合。通过将AFM与光学显微镜相结合，我们可以克服这些问题，并提供新的特性，如识别和定位感兴趣的分子/受体和定向力测量。

特征亨廷顿疾病的原子力显微镜

在本文中，我们将重点关注亨廷顿的疾病，这是一种渐进式常染色体显性障碍，这是由亨廷顿（HTT）的谷氨酰胺流动膨胀引起的，并导致精神病，电机和认知障碍。尽管已经提出了多种病理机制，但这种疾病的原因的原因仍然不清楚。

与所有聚谷氨酰胺疾病一样，亨廷顿的疾病通过含有细胞内聚体的聚谷氨酰胺蛋白质的存在病理学。在这里，我们使用Biosching™II的独特能力与倒光学显微镜结合，以进行由细胞内蛋白质聚集体组装的突变亨廷特汀引起的细胞效应的活细胞研究。我们还将突出我们工具的成像能力，特别是AFM和细胞荧光成像的组合。在该两部分串的原子力显微镜的第二篇论文中，我们将强调生物镜II的力光谱能力。

CHO-K1细胞的制备

用yfp标记的huntingtin外显子1片段(HttexQ68-EYFP,AS 1-90;68 polyglutamines)。2 × 10转染^5.每孔3µl Fugene HD (Roche)。随后，在6孔板上的无菌盖片(18x18mm)上播种细胞。孵育24-48h后，用PBS洗涤两次，用4% PFA固定10分钟。

使用配备AxioCam MRc摄像机和AxioVision软件的Zeiss Axio观测器记录Brightfield (BF)、差分干涉对比度(DIC)和epifluorescence图像。所有AFM图像使用MLCT和DNP-20悬臂梁记录在Veeco Bioscope II上。该系统将AFM和光学测量相结合，作为一个完全集成的工具。所有实验都是在PBS缓冲液中接触和TappingMode™进行。使用Veeco的VISION软件包对AFM高度图像进行3d渲染。

AFM与光学数据的配准与关联

对于AFM和光学数据的正确配准和关联，关键是要有能力在光学视野内校准AFM尖端，以及相对于样品上感兴趣的区域的尖端。

BioScope II上的手动和电动xy平移平台提供了一种简单和有效的针尖/光学和针尖/样品对准方法。从低放大率开始——这为样品和AFM尖端位置提供了更大的视野——杭丁素聚集体可以通过各种光学对比技术清晰地检测到;在BF中，在epifl荧光中，基于yfp标记的htt介导的强荧光信号，在DIC中，基于htt的聚集改变细胞拓扑结构。

我们首先使用手动X-Y平移台将AFM尖端定位在视场的中心(这在切换到更高放大倍率时很重要——因此视野更小)。然后我们使用电动舞台来定位一个感兴趣的区域相对于尖端。这样，尖端和感兴趣的区域通常都在视野的中心。

在图1中,我们展示了一个例子,这样的状况:图片1 a和1 b显示了BF和所选区域的荧光图像,分别,但悬臂不是位于这显示窗口(尖的形状是可见的在图像右下角1 a)。使用连续的手动和机动阶段，它是非常容易的移动tip刚刚以上的地区感兴趣。

图1所示。使用“导航”功能到达感兴趣的区域。(光明存在误伤图像)和B (fl uorescence图像),感兴趣的计画一些明亮的总量是可见的,但建议是远离样本和存在误伤的视图(见影子图像的右下角)。使用X,Y运动螺丝和操纵杆允许放置在感兴趣的区域的顶部(C和D，亮场和荧光图像，分别。)用20倍物镜获得的光学图像。

将尖端和感兴趣的区域定位在光学视野的中心也将有助于最小化一些可能影响图像配准精度的光学像差/扭曲效应。这些像差(彩色的和球形的)对于一个特定的物镜来说在视场的外边缘更普遍，在光轴内/周围最小。

提高原子力显微镜的精度

BioScope II的电动舞台设计非常稳定，有助于获得高度精确的图像。BioScope II的三个电机螺丝不旋转，不像大多数AFM的;相反，马达螺丝直接进出头部。这为AFM尖端提供了一个“无摆动”的方法，有助于在接合过程中保持样品上感兴趣区域的准确定位。NanoScope®V Controller的软件自动接合程序提供了快速但安全的接合样品表面的针尖。当对软样品成像时，这是至关重要的——为了保存样品和AFM探针。

1C (BF)和1D(荧光)图像是在接近程序的最后一步拍摄的。有趣的是，用于AFM检测的红外激光对BF和表观荧光图像没有干扰作用。该红外超发光二极管不干扰红色生物荧光团。在850纳米时，如果客户有一个红外敏感相机，想要从他们的光学图像中去除观察到的AFM尖端周围的激光溢出，它也可以很容易地过滤。

图2是AFM和荧光成像相结合的研究类型的一个直接例子。图2A、2B和2C分别对应BF、DIC和荧光，显示突变体杭丁顿蛋白的聚集。图像中的箭头表示选择用AFM尖端扫描的特定聚合体，而红色标出的区域表示AFM尖端的扫描区域。图像2D显示了相应光学图像中轮廓区域内细胞的三维AFM形貌图像。

图2．利用原子力显微镜生成光学显微镜的附加信息。突变yfp标记的htt蛋白形成明亮的聚集物(图像A，亮场和B, DIC，图像C，表观荧光，黄色箭头)，也很容易在AFM的地形通道中识别(图像D，红色箭头)。此外，AFM扫描也可以检测到与聚集引起的细胞亚结构相似的其他细胞亚结构引起的细胞拓扑变化(图D，绿色箭头)。用20倍物镜拍摄的光学图像。AFM扫描：90x90x3μm。

光学显微镜(黄箭头)观察到的杭丁顿蛋白聚集体也很容易在AFM图像(红箭头)中观察到。虽然存在各种AFM表面的细胞很容易观察到AFM,地形成像还不足以让你区分不同类型的聚合物(除了YFP-tagged总量影响其他细胞子结构单元拓扑发现在AFM扫描(图片2 a、2 b和2 d绿色箭头))。通过将AFM与光学显微镜相结合，在相关荧光图像中荧光信号的存在或缺失可以让人们准确地识别聚集物是否由杭丁蛋白组成。

注意，一些细胞表现出均匀的荧光细胞染色，这是由于整个细胞细胞质的可溶性亨廷蛋白存在。相比之下，已经积聚在聚集体中的突变亨廷蛋白含有局部非常强的荧光，因此易于识别。

图像收集使用各种物镜，放大范围从20倍到100倍，以及一个高数值孔径100倍TIRF物镜。然而，由于杭丁素聚集物的强荧光强度，最好的结果是在20倍物镜下的表面荧光。

横截面分析 - 亨廷汀聚集非常异构

在完整系列的实验之后，在纳米腔软件中进行的横截面分析揭示了亨廷顿的尺寸和形状，从几百颗粒直径（〜4μm）的尺寸和形状明显异质。摩擦图像（数据未示出）揭示了聚集体与细胞的大量之间的对比度。

在TAPPPEMODE（数据未示出）中收集的相位图像也表现出聚集体区域中的有趣相位对比度。样品上的相对相位变化（或对比）通常可以指示表面性质的差异，例如粘弹性或静电电荷分布。因此，与聚集体对应的区域中的相位对比度表示它们由与周围细胞表面不同的材料或组件组成。

我们还研究了表达野生型杭丁顿蛋白的细胞(数据未显示)。在这种情况下，杭丁蛋白仍然是可溶性的，因此，没有检测到杭丁蛋白聚集介导的细胞拓扑结构的变化。

总结

在目前的研究中，BioScope II的成像能力与荧光显微镜相结合，以定位和成像突变亨廷顿蛋白聚集物，亨廷顿病的特征标志。该应用表明，该组合系统在生物系统中分子的三维识别和物理性质的研究中具有很高的选择性和准确性，通过光学成像和地形、摩擦、粘弹性和黏附测量。该技术在活细胞中纳米分子复合物的综合功能分析及其与疾病发生和进展的相关性，以及在药物发现中测试新化合物的生理效应等方面具有广泛的应用前景。

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