共焦显微镜使用点光源(激光),聚焦到样品。反射的光(荧光)通常是收集相同的目标,集中到一个针孔的探测器。这可以确保只有光从焦平面图像可以到达检测器,强烈增加图像对比度和,通过适当的选择针孔大小,略增加分辨率。
在共焦拉曼成像alpha300R系统这里描述用于实验,特殊的过滤器是用来抑制反射的激光,使拉曼散射光与光谱仪/ CCD摄像机检测到的组合。获得一个图像,成千上万的光谱与通常在很短的时间内获得不到100毫秒每光谱积分时间。
拉曼散射截面很小和励磁功率仅限于几毫瓦,一个人怎么能改善共焦拉曼系统的总体敏感性?
噪声的来源
优化的重要因素是信噪比(S / N)。第一步是提高收集到的拉曼信号。可以通过优化吞吐量的显微镜和分光计和通过使用一个客观的高数值孔径(NA)。共焦的设置有助于减少不必要的背景信号从失焦领域,进一步增强了S / N。
选择一个合适的探测器
下一个是选择一个合适的探测器灵敏度最高的,比如背景CCD,量子效率超过90%。探测器本身的噪声的主要来源是暗噪声和读出噪音。目标必须消除所有的其他噪声来源,以便只有光子散粒噪声仍然存在。
作为光子遵循泊松统计,对于一个给定的信号的不确定性是电子信号的平方根。在缺乏其他噪声源,100年一个信号电子,S / N不能大于10。
黑暗的噪音
暗噪声是由于CCD热生成的运营商,可以极大地减少了CCD的有效冷却。一个好的CCD热暗电流小于0.01电子/像素/秒-60°C。因此,冷却-60°C以下不需要集成的几秒钟。
集成的时候不到100毫秒,在共焦拉曼设置,暗电流是完全可以忽略不计。读出噪声产生,将收集到的电子转换成数字计数和受到CCD´s读出放大器的质量以及速度(数字化)的读出过程。
读出噪声
读出噪声是由相机制造商和在指定的电子。50 khz的典型值是5 - 10电子读出速率约30电子速度2.5 MHz读出。
如果读出噪声超过光子散粒噪声,信号读出噪声限制。在正常光谱实验一个只会增加积分时间获得足够的信号,以确保信号散射噪声是有限的。不幸的是,在共焦拉曼显微镜这并不总是可能的。
如果一个人获得一幅图像组成的128像素/线和128行只有1 s集成时间/频谱,总收购时间是4,5个小时,这是减少到100 ms的集成时间少于30分钟或者不到3分钟10 ms的集成。不幸的是,探测器的读出越快,越嘈杂的读出放大器。
1024 x128像素CCD配有50千赫读出放大器可以读出在大约22女士,也是最短的积分时间。如果我们假设的读出噪声10电子,每个信号低于100 /像素读出电子有限公司(泊松噪声<读出噪声)。如果读出噪声是30电子快速读出放大器,甚至900电子信号(~ 1000光子/像素探测器)将读出有限。
电子倍增CCD或EMCCD
电子倍增CCD (EMCCD)是一个正常的CCD额外读出寄存器与更高的时钟驱动电压比普通CCD读出寄存器。由于时钟高电压,通过碰撞电离电子乘法是通过一个可调的总放大1000倍的信号。这个设置,它总是可以放大上述信号读出噪声,信噪比总是有限的泊松噪声信号,即使非常快的读出放大器使用。作为一个例子,一个1600 x 200像素EMCCD 2.5 MHz读出放大器,用于实验在这篇文章中,可以读出只有2.3 ms。
Improvi的例子ng信号噪声比
下面的计算显示改善的S / N可以预期不同的信号。假设CCD的量子效率(QE)是90%,而放大的信号被设置为一个价值1 a / D数等于电子数的读出噪声(1 a / D数= 30电子为2.5 MHz读出放大器)。
1——没有一个EMCCD示例
如果100个光子落在CCD像素在一个给定的积分时间,90电子将生成和转换为3 a / D。读出噪声将1 A / D计数和泊松噪声将是9.5,这是大约0.3 A / D。与这些数字,S / N比率约为2.6。
示例1 - EMCCD
EMCCD,信号将被乘以电子增益系数可高达1000。更小的放大系数通常被使用,但对于计算它不产生影响。90年电子将被放大到90000电子导致3000 A / D。泊松噪声是9500电子转化为317项,而1计数读出噪声是完全可以忽略不计。S / N是9.5,这是一个提高3.6倍。
2 -没有EMCCD的例子
如果信号只有10个光子,这将导致的信号只有0.3普通CCD。在这种情况下泊松噪声可以被忽视。1计数读出噪声、S / N是0.3,几乎没有一个可探测的信号。
例子2 - EMCCD
EMCCD,信号333和泊松噪声是100数量给出了3.3的S / N,在普通CCD的11倍的改善。
多余的噪音和EMCCD的
在现实中电子倍增过程本身增加了一个额外的,所谓的过剩噪声系数约为1.4,所以,真正的改进S / N分别降至2.6和7.9上面的例子。
更高的信号EMCCD的不需要
为高信号,信号强度不再是读出有限,多余的电磁过程的噪声系数降低了EMCCD的信噪比低于正常CCD。在这种情况下,新兴市场注册可以关掉,然后使用“正常”读出寄存器。因此,EMCCD的表现就像一个正常的黑色背景CCD。
案例研究
共焦拉曼成像的PMMA薄膜玻璃衬底
图1显示了三个共焦拉曼图像极薄的PMMA薄膜,spin-coated到玻璃亚态。在图像的中心,一个垂直划痕是用金属针去除有机层。膜厚度,测量了AFM在这个划痕是7.1海里。这是观察到有一个额外的污染层厚度4.2 nm。的起源和材料组成最初这个污染层是不清楚,但可能是由共焦拉曼测量。
图1所示。a - c:共焦拉曼图像获得的7.1纳米薄层有机玻璃CH2伸展带大约3000 /厘米。比例尺:10μm。图1 d:示意图的样本30 x 50μm = 8000 100 x 80像素光谱,光谱110 ms /。
拉曼成像没有EMCCD
通过收购获得的图像是200 x 200拉曼光谱在50 x 50μm扫描范围和整合CH的强度2拉伸的PMMA在3000左右/厘米。励磁电源使用100 x 20 mW @532 nm, NA = 0.9的目标。图1得到的标准背景(BI)使用62 kHz CCD读出放大器和36女士集成时间/频谱。稍微发挥一点想象力,在图像的中心是可见的,但信噪比远小于1。
拉曼图像放大荷兰国际集团(ing)与EMCCD
图1 b显示了相同的一部分样本成像EMCCD获得约250。图像显示几乎相同的S / N,但现在集成时间仅为3.6 ms,比图片1快10倍。图1的完整图像采集花了25分钟,但是只有3.4分钟图1 b。图1 c与EMCCD拍摄,但现在与图1相同的积分时间。人们可以清楚地看到,而且污染的形式针状的结构在PMMA和玻璃表面,这将在稍后讨论。图1 d显示了样例的草图。
拉曼成像使用石油mmersion客观
接下来的图片,样品是天翻地覆,油浸物镜与NA = 1.4。集成时间是7 ms /频谱导致总收购时间5.4分钟(包括0.3 s / back-scan线)。
图2显示了12图像获得了在同等条件下与不同的增益设置从16 x 1000 x, CH周围的信号2拉伸带综合获取的图像。可以看到,信噪比强烈增加约200倍的增益设置。上面,没有进一步改善S / N是可见的图像。
图2。比较共焦拉曼EMCCD获得的图像获得不同的设置。
信号噪声定量与EMCCD收益
在图3中,信号的信噪比CH2乐队一直延伸至PMMA策划反对EMCCD的收获。信号的标准差为噪音。可以看到,增加信号的增益300 x,这似乎是最佳设置。高于这个值,S / N值略有减少。使用适当的增益系数,整体提高5倍以上。
图3。信噪比的信号CH2拉伸的PMMA策划反对EMCCD增益。
想象材料分布亚博网站下载
由于共焦深度分辨率有限,没有获得的光谱纯PMMA光谱或纯光谱的污染层。然而,通过平均所有光谱获得擦伤的面积没有污染,纯玻璃光谱。后续的玻璃光谱减法PMMA光谱以及频谱的污染,纯PMMA和污染光谱可以计算。这些光谱为基础分析,每个测量光谱的基本谱拟合的线性组合。使用这种技术,三个图像分布的三个组件(玻璃、PMMA和污染)可以获得的颜色(蓝色=玻璃,红色= PMMA和绿色=污染)想象他们的分布(图4)。图5显示了光谱的不同组件。为了更好的比较,他们显示相同的最大强度。体系光谱放大20倍左右,污染光谱对玻璃光谱约15倍。
图4。彩色图像共焦拉曼7.1 nm的PMMA层(红色)和4.2纳米污染层玻璃(蓝色)(绿色)。女士7,200 x 200光谱积分时间/频谱。总收购时间5.4分钟。
图5。拉曼光谱的计算拉曼测量在图4中,显示相同的最大强度。规模只有纠正PMMA。体系光谱放大20倍左右,污染光谱对玻璃光谱约15倍。
识别污染物的阶段
从这个,绿色的光谱(污染)可以很容易地确定为烷烃。样本准备AFM厚度调查前几周拉曼测量和存储在一个聚苯乙烯(PS)容器。这些PS容器是由注塑和烷烃用于涂层模具更好的分离。作为样本存储(可能在温暖的环境中),烷烃的一部分蒸发和浓缩样品,这解释了针状的结构和涂层也涵盖了。
优化结果
图5是正确的PMMA的规模和显示最多只有28项。信号平均完成CH2拉伸政权(330 /厘米或150像素)1965项。的EM增益测量约为600 x,所以只1965项对应于99电子光子(110)和1.4光子总最大/ CCD像素!但如何获得一个良好的拉曼光谱,所以一些电子吗?
大约20000个光谱的原因是,平均计算PMMA频谱图5所示,所以整个信号是20000倍。然而,只有那些光谱被PMMA。为此,每个光谱信号必须强大到足以显示分布的PMMA的拉曼形象,这样一个能够选择正确的平均光谱。可以看到,每EMCCD像素超过1.4光子足以想象PMMA层的分布在本例中,选择合适的光谱平均的过程。
结果将是更让人印象深刻的是如果没有背景信号的衬底CH2拉伸政权会被使用。图6显示了三个光谱的玻璃,烷烃和PMMA强度相同的规模。可以看到,使用的玻璃衬底与大约一半的小型拉曼峰信号的PMMA和大约三分之一的烷烃信号在这个地区。很明显,拉曼系统的confocality detectibility薄层的是至关重要的。
即使最好的共焦设置,信息深度至少500海里这意味着500纳米玻璃的拉曼信号。作为拉曼信号成正比的材料数量,一个标准(non-confocal)设置收集玻璃信号超过300倍(170μm覆盖玻璃厚度),使检测薄涂料层的不可能的,即使有更长的集成。
图6。在图5光谱一样,但正确的规模。
总结
这是证明了EMCCD相机的使用可以大大提高检测效率和速度,特别是短期集成*必要用共焦拉曼显微镜。7.1 nm PMMA的分布以及4.2 nm烷烃层玻璃衬底上可以很容易地发现和确定的积分时间只有7 ms /频谱,这降低了整体收购时间5.4分钟为200 x 200(= 40000)共焦拉曼光谱图像。
对于很小的信号由CCD´s读出噪声、EMCCD的使用可以提高信噪比的5 - 10倍比最佳可用标准CCD´s,而对于较大的电子信号相乘电路可以被关闭,所有属性的标准(背景)CCD维护。
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