High Throughput Analysis of Tetracycline in Animal Tissue

四环素（TCS）是动物生产部门中最常用的抗生素之一，主要用于防止感染，治疗疾病和保护动物生长。

抗生素（例如四环素）的过度使用可能导致源自动物的食物（例如牛奶和肉类）的残留违规。这些残留物可能对人类健康和福祉构成风险。

食物中的四环素残基可能导致毒性以及许多副作用，包括过敏反应，也可能引起细菌耐药性，然后可以将其转移到人类中。

全球监管机构已经建立了最大的残留水平（MRL），这是食品中兽药的公差，以保护人类健康。欧盟，中国和加拿大设定了他们所说的“食物中药物残留的最大残留水平”。同时，美国称这些“容忍度”。^1,2

采用灵敏且高度选择性的技术，以确保基于监管要求准确监测四环素是维护人类健康的关键工具。本文展示了一种用于对肉类四环素快速，敏感和定量分析的UHPLC/MS/MS方法。

为了提高实验室的生产率，QS-Works高吞吐量自动采样器被利用。该仪器的温度控制托盘，大容量和机器人臂都有助于促进无人看管的延长时间。

QS-Works还可以使实验室按顺序运行多达600个样本，从而提高了测试实验室的效率。

The method developed here demonstrated the sensitivity, recovery, precision linearity and selectivity necessary for analyzing tetracyclines in meat at low tolerance levels set by different regulatory bodies around the globe.

实验

硬件和软件

色谱分离是在Perkinelmer Qsight上进行的^®LX50 UHPLC系统。使用Perkinelmer Qsight获得了检测^®420 ms/ms检测器。

使用高容量的QS-Works AutoSampler来提高实验室的生产率。Simplicity 3Q™软件平台用于促进仪器控制，数据采集和随后的数据处理。

LC方法和MS源条件

Table 1 displays the LC method and MS source parameters. Table 2 shows various reaction monitoring mode (MRM) transitions of the tetracyclines. A minimum of two MRM transitions was monitored for each analyte. This was done to reduce the number of false positive and negative results in the method.

MS/MS参数的优化，包括分解变量，例如选择父离子和产品离子（CCL2），入口电压（EV）和碰撞能（CE）（CE），是通过标准输注来完成的。

通过用LC流对整齐的标准标准的T输液来实现源条件的优化。采集MS方法是根据这些优化条件进行的。

表格1。LC方法和MS源参数。资料来源：Perkinelmer食品安全和质量

	LC和MS条件
移动阶段A。	水（含0.1％草酸）
流动阶段b	Acetonitrile (contains 0.1% formic acid)
柱子	Perkinelmer Quasar spp农药，100×4.6毫米；2.7μm，（N9306880）mm
柱烤箱温度	20 °C
自动采样器温度	20 °C
Injection volume	5μL
ESI电压（正）	5100 v
干燥气体	120
Nebulizer gas	250
源温度	350°C
HSID temperature	250 °C

表2。MRM过渡。资料来源：Perkinelmer食品安全和质量

复合名称	前体离子/DA	产品离子/DA	CE/V。	EV/V	CCL2/V
OxyTetracyline	461.3	426.3 201.2	-21 -49	31 25	-136 -180
四环素	445.3	410.3 427.3	-22 -15	29 27	-144 -124
Chlortetracycline	479.2	154.0 444.2	-34 -25	26 29	-136 -164
doxytetracycline	445.3	154.1 154.0	-35 -34	29 26	-140 -136

标准和样品准备

Every reagent, solvent and diluent utilized were LC/MS grade. All TC standards - which were stored at -20 °C in freezer conditions to prevent their degradation - were obtained from Sigma-Aldrich^®Inc.

每个TC在甲醇中制备用于尖峰和校准阶段的库存和混合药物溶液。为了防止标准降解，所有的工作标准和库存都在冰箱条件下存储，直到准备使用。

To make a homogenized sample, the following procedure was followed:

• 将代表性的肉样品切成小段，然后混合。
• A 1 g aliquot of the homogenized meat sample, along with an 8 mL measure of 0.1 M aqueous EDTA solution were placed in a 50 mL centrifuge tube and vortexed.
• 然后将17毫升的乙腈度量放在同一管中并进行涡流。
• This tube was subsequently placed in freezer conditions and maintained at -20 °C for 30 minutes.
• This was followed by centrifuging for 10 minutes at 4000 rpm.
• An 8 mL measure of supernatant was then transferred into a 50 mL clean centrifuge tube, with 5 mL of hexane added for sample defatting.
• 将管子涡流3分钟。
• 此后，将溶液在4000 rpm下离心1分钟。
• 然后将3毫升的下层转移到新的15毫升离心管中。
• 通过在50°C的温度下将氮吹在其上，将其蒸发为干性。
• 通过将其溶解在1 ml甲醇/水（30/70，V/V）溶液中，将其溶解为重构，该溶液中含有0.01 m的草酸。
• 在注入LC/MS/MS系统之前，将这些样品提取物进行涡流并通过0.2 µM PTFE注射器过滤器过滤。³

结果与讨论

这项研究的目标是评估大容量QS-Works AutoSamplerwith a validated sample preparation method to determine the levels of tetracyclines in a meat sample.

采用高吞吐量自动采样器（例如QS-Works）提高了测试实验室的生产率和效率。

如果食品测试实验室有大量的样品可以分析，则QS-Works可以快速处理样品，同时由于使用机器人采样单元而增强了数据质量和一致性（图1）。

Figure 1.QS-Works AutoSampler。图片来源：Perkinelmer食品安全和质量

Either the maximum residue levels (MRLs) set out for tetracyclines in foods by Health Canada or the tolerances established by the US FDA were utilized as the reference target levels, shown as X in Table 3. The detection threshold - the ‘yes/no’ screening level - should be at or below 0.5X.

在图2中可以看到4个具有良好峰值分辨率的四环素的色谱图（XIC）。通过监测两个离子跃迁进行识别和确认。

Figure 2.a）氧气的XIC色谱图，b）四环素，c）chlortetracycline，d）doxytetracycline。图片来源：Perkinelmer食品安全和质量

This allowed for higher selectivity and specificity in identification. The ion ratios were computed by calculating peak area for less intense ion to peak area for more intense ion to generate ion ratios.

由于食品样品矩阵的多样性和复杂性，样品基质效应（MES）是LC/MS/MS方法开发的主要关注点。

已知ESI容易受到存在电荷编组矩阵组件的分析物的电离抑制。已经确定了基质诱导的增强效应在ESI中发生，这也可能引入巨大的定量偏见。

为了克服样品ME，已经使用了几种方法。其中包括样品稀释，使用稳定的同位素内部标准标准，基质匹配（mm）校准，标准添加，样品清理和使用高效率柱以改善分离。

通过比较从肉类样品基质获得的校准曲线与仅试剂（RO）样品获得的斜率，评估样品基质效应（MES）。

根据斜率之间的百分比差异计算每个分析物的样品ME（％）。大多数化合物的MES小于20％（表3）。

为了克服基质效应并减少分析结果的变化，本研究中采用了基质匹配的校准来定量每个分析物。

The calibration was carried out utilizing both matrix-matched (MM) and reagents-only (RO) standards. Every calibration curve built from both the RO and meat sample matrices displayed good linearity with correlation coefficient (R²) larger than 0.99. Examples of typical calibration curves can be seen in Figure 3 and Figure 4.

Figure 3.Calibration curves of tetracyclines obtained from standards prepared in reagent only. Image Credit: PerkinElmer Food Safety and Quality

图4。从肉样品基质中制备的标准品获得的四环素的校准曲线。图片来源：Perkinelmer食品安全和质量

在高浓度标准后通过注射试剂空白来评估结转。在执行的任何实验中均未观察到遗留。

To avoid chelation of tetracyclines by metal ions of LC parts or column body and maintain good peak shape and reproducibility over the run, oxalic acid was added into aqueous mobile phase.³

该方法显示出五个重复的RSD少于5％的精度。表3显示了在流动相中使用草酸对可重复性的重现溶剂对可重复性的影响。

通过将草酸添加到流动相和重建溶剂中，可以改善每个分析物的可重复性和峰形状。发现对每个四环素分析的LOQ低于其在肉类样品中的允许公差水平。

这表明该应用在耐受水平上对肉类四环素分析的敏感性超过了足够的灵敏度。

TCS的定量估计限值基于信号/噪声（S/N）的比率为10。所有研究药物的LOQ为1.5±1.0 µg/l。

The findings showed that the developed method is suitable for use in the fast screening and quantification of四环素在肉样品中。

The absolute recoveries of tetracyclines were in the range of 70-120% (Table 3). Utilizing a deuterated tetracycline can be used to compensate for losses of tetracyclines with this extraction process in the future.

Table 3.保留时间，矩阵效应（ME），线性，恢复和可重复性的结果（％RSD）。资料来源：Perkinelmer食品安全和质量

复合名称	等级 （ng/g） 宽容 （X）	RT (min)	我 （％）	线性 （r2)	恢复 （％）	RSD with oxalic acid （％）(n=5)	不含草酸的RSD （％）(n=5)
OxyTetracyline	200	3.09	86	0.9984	70.0	4.6	11.0
四环素	200	3.26	80	0.9997	116.0	4.9	16.0
Chlortetracycline	200	3.65	96	0.9991	87.3	1.9	9.5
doxytetracycline	200	3.73	94	0.9980	71.6	1.5	8.0

结论

使用Perkinelmer高吞吐量QS-Works AutoSampler和LX 50 UHPLC与QSight 420 ms/ms系统耦合的UHPLC/MS/MS方法的开发，对族裔肉类样品中四环素的识别和量化量很灵敏。

通过这种方法获得的低水平检测水平可以促进常规筛查和定量分析应用中低调节限制的支持。

参考

1. 2017年8月，加拿大卫生部食品中兽药的最大残留限制清单（MRL）。https://www.canada.ca/en/health- canada/services/drugs-health-products/veterinary-drugs/maximum- residue-limits-mrls/list-maximum-residue-limits-mrls-veterinary-drugs-食物。2020年11月访问。
2. 标准方法性能要求（SMPRS^®）用于筛查和鉴定食物中兽药残留物的识别方法。smpr2018_010.pdf（aoac.org）。2020年11月访问。
3. AurélienDesmarchelier，SébastienAnizan，Mai Minh Tien，Marie-Claude Savoy＆Cindy Bion（2018）基于LC-MS/ MS的五个四环素及其empimers的确定，该测定基于低温，食物辅助和污染物的液体液体提取：A部分，35：4，687-695，doi：10.1080/19440049.2018.1427894

致谢

Produced from materials originally authored by Saba Hariri, Abir Khaled, Avinash Dalmia and Feng Qin from PerkinElmer, Inc.

此信息已从Perkinelmer食品安全和质量提供的材料中采购，审查和改编。亚博网站下载

有关此消息来源的更多信息，请访问Perkinelmer食品安全和质量。