色谱分离和大豆异黄酮的定量

异黄酮是由Fabaceae植物家族成员几乎完全产生的天然存在的水溶性化合物。

起源于各种植物和食物来源，异黄酮以多种形式发生，包括糖蜜（Daidzein，糖酸酯和甘氨酸），葡糖苷（Daidzin，Genistin和缩曲杆菌）及其乙酰基和丙二酰缀合物。

异黄酮的糖苷酮物种是生物活性的，而葡萄糖苷和缀合物通过细菌β-葡糖苷酶在肠中进行水解，释放相应的糖基。图1显示了三种糖蜜的结构，以及它们的等同葡糖苷。

图1。本研究分析的异黄酮化学结构。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量

与雌激素雌激素的结构类似，异黄酮被分类为植物雌激素，并通过身体主动与雌激素受体结合。

虽然植物雌激素的雌激素效应通常比天然雌激素的雌激素效果较弱，但结果可以对人体具有正面和负面影响。

植物雌激素已经证明了减少许多癌症的发育潜力的能力（例如乳腺，子宫内膜和前列腺癌），抑制骨质疏松症的发作并提高LDL与HDL胆固醇的比例。^1-4

然而，研究还争辩说，植物雌激素的内分泌破坏性质可以加剧现有的甲状腺障碍。^5.

如今，市场上有广泛的异黄酮补充剂，其中许多是营养保健品。因此，为了保护人类健康并确保补充剂中包含治疗活性成分的治疗水平，确认标签索赔精度对于开发和制造营养制品至关重要。

美国药典（USP）和官方农业化学家（AOAC）的协会均通过高效液相色谱（HPLC）确定了在各种补充中评价异黄酮的方法。^6-8

然而，这些分析方法对于高吞吐量实验室来说可能是不可行的，并导致消耗大量溶剂。

尽管存在几种异黄酮的分析方法，但该项目的目的是推进更简单，更快，更可靠的液相色谱法，用于评估大豆营养素补充中最常用的异黄酮。提供方法条件，其包括性能数据，例如线性度和可重复性。

实验

硬件和软件

采用色谱分离PerkinElmer LC 300 UHPLC系统包括LC 300 18K PSI UHPLC泵，LC 300 UHPLC自动进样器，具有温度控制的样品隔室和内柱烤箱。

通过LC 300光电二极管阵列检测器（PDA）完成检测。使用SimpleCity™RHOB CDS软件平台进行仪器控制，分析和数据处理。

方法参数

LC参数描述于表1中。

表格1。LC参数。资料来源：PerkinElmer食品安全和质量

。	。
柱子	PerkinElmer Brownlee SPP C18，2.7μm，75 x 2.1 mm（零件＃n9308403）
移动阶段	溶剂A：HPLC或LC / MS级水，0.1％甲酸 溶剂B：HPLC或LC / MS级乙腈，具有0.1％甲酸 溶剂计划：线性梯度 步 时间 （分钟） 流速 （ml / min。） ％一种 ％B. 1 0.00 0.600 88. 12. 2 0.10 0.600 88. 12. 3. 6.00 0.600 70 30. 4. 6.99 0.600 70 30. 5. 7.00 0.600 88. 12.
分析时间	7.0分钟。
平衡时间	2.0分钟。
压力	〜5500 psi / 380 bar最大值
烤箱温度。	30ºC.
样品温度	周围
注射卷。	5μl.
检测波长	260 nm带宽15 nm参考波长：400带宽40 nm
数据收集率	5 PTS / SEC（HZ）

溶剂和标准制剂

所有使用的溶剂和稀释剂均为HPLC或LC / MS等级。从Sigma-Aldrich获得了三种糖苷酮和三种葡糖苷标准^®，Inc（St.Louis，Mo）粉末形式。

这些标准含有Daidzin，Daidzein，Genistin，Genistein，糖蛋白和糖酸酯。USP脱脂粉末大豆参考资料也来自Sigma-Aldrich^®，Inc（圣路易斯，MO）。

通过将5-10mg的每种标准物溶解在约400μg/ ml的单一的储备溶液中，通过将5-10mg溶解到乙腈中来完成制备。通过加入各个储备溶液的适当等分试样来制备混合标准溶液，并用水和乙腈稀释到最终体积，使得溶剂为50:50水：乙腈。

通过用75:25水连续稀释混合标准来进行校准剂的制备：乙腈。标准的最终浓度显示在下表2中。

表2。组化合物是Daidzin，Daidzein，Genistin和Genistin。B组化合物是缩水糖蛋白和糖型素。资料来源：PerkinElmer食品安全和质量

解决方案名称	一组粗。 （μg/ ml）	B组CENC。 （μg/ ml）
STD-A.	10.00	5.000
STD-B.	5.000	2.500
STD-C.	2.500	1.250
STD-D.	1.250	0.6250
STD-E.	0.6250	0.3125
STD-F.	0.3125	0.1563
STD-G.	0.1563	0.07813
STD-H.	0.07813	0.03906

USP脱脂粉末大豆参考材料用于制备乙酰基和丙二酰基保留时间检查溶液，如USP Isoflavone胶囊中所述。

在120℃下在开放的容器中加热一份200mg部分，持续2小时。将第二部分的参考材料容易称量为合适的小瓶。两者都制备，包括2ml乙腈和1.2ml水，然后混合1小时。

将另外的1.8ml水引入每个小瓶，彻底混合，离心，并使用0.45μmPVDF过滤器过滤。在分析之前，将等分试样进一步稀释1：1。

样品制备

三种不同的膳食补充剂，包括大豆异黄酮，从当地的健康食品店获得。只包括感兴趣的大豆异黄酮，而另外两个包括一系列补充草药成分。

合并每个补充剂的内容物并从五个胶囊中称重。称量汇集材料的量，以提供约5mg的异黄酮，以预先在标签给药量上进行。

通过加入10mL乙腈和6mL水，然后混合1小时，制备样品在USP专着中详述。^6.将另外的9mL水引入每个小瓶，充分混合，离心并利用0.45μmPVDF过滤器过滤。在分析之前，将等分试样在1：1的水中进一步稀释。

结果和讨论

这色谱在图2中显示高浓度标准（STD-A，10.0 /5.0μg/ mL）。图3显示了脱脂大豆粉末作为参考材料的加热样品的色谱图。

图2。10.0 / 5.0-μg/ ml异黄酮标准的色谱图。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量

图3。加热USP脱脂粉末大豆显示峰值鉴定：1）丙二酰硫脲3）丙酮甘氨酸3）乙酰甘氨酸5）乙酰缩曲蛋白5）丙酮酰基甘氨酸6）乙酰吉氨酸素。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量

这与非热水样的样品结合使用，用于确定异黄酮的乙酰基和丙酮酰胺共轭形式的保留次数。这些化合物被认为是不稳定的，并且参考标准不易易于访问。

由于这些化合物不包括在校准标准中，因此使用USP专题中详述的方法计算量。

等效葡萄糖苷校准曲线用于计算使用校正因子增强的浓度。图4显示了六种复制2.5 / 1.25-μg/ ml异黄酮标准注射的叠加层，显示出优异的再现性。

图4。6.5 / 1.25-μg/ mL异黄酮标准的6重复的色谱覆盖物。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量

保留时间重复性小于0.01分钟，所有分析物的峰值面积％RSD小于0.5％。

图5显示了在测试的浓度范围内的所有六种异黄酮化合物的校准结果。所有六种化合物都表现出良好的线性（1阶）适合并且具有r²系数大于0.999。

图5。用于三级葡萄糖苷和三个糖苷类异黄酮的8级校准组的结果。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量

如表3所示，针对每个分析物记录检测限（LOD）和定量限制（LOQ），并根据在低标准（STD-H，N = 6）和下测量的响应的标准偏差计算每个分析物的校准曲线的斜率。

表3。六个分析物的LOD和LOQs，按洗脱次数。资料来源：PerkinElmer食品安全和质量

分析物	计算的lod. （μg/ ml）	计算Loq. （μg/ ml）
Daidzin.	0.0099.	0.0330
缩血蛋白	0.0063	0.0209
Genistin	0.0092	0.0306
达迪辛	0.0028	0.0095
糖酸盐	0.0062	0.0208
Genistein.	0.0026	0.0085

样本结果

使用相同的色谱条件，然后分析制备的三种补充样品。补充剂A和B的色谱结果在视觉上类似，具有大多数异黄酮含量为葡萄糖苷Daidzin和Genistin的形状，如图6所示。

图6。补充剂A和B的代表色谱图。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量

如图7所示，样品C显示测量分析物的不同相对浓度的测量分析物的相对浓度，明显地以较高的乙酰基和丙基缀合的葡糖苷。

图7。补充剂C的代表性色谱图。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量

三种胶囊样品的定量结果显示在下表4中。样品A和B在色谱上和定量地进行了相似的曲线。

两种产品由相同的制造商制造和细节相同的成分源。样品C由不同的制造商制造，并列出了不同的成分来源。

表4。在三个样品中检测到异黄酮浓度。资料来源：PerkinElmer食品安全和质量

分析物	样本A. （μg/ ml）	样品B. （μg/ ml）	样品C. （μg/ ml）
Daidzin.	76.6A	67.9A	84.8A
缩血蛋白	10.3A	14.4A	47.3A
Genistin	106A	105A	25.0a.
Malonyl Daidzin.	0.364	0.378	18.1
丙酰缩水糖蛋白	0.156	0.134	8.04
乙酰·德齐汀	4.74	4.10	7.51
乙酰缩水糖蛋白	0.520.	0.723	3.23
Malonyl Genistin	n	n	4.98
达迪辛	0.941	0.887	3.794
糖酸盐	0.351	0.512	1.74
乙酰吉氨酸	7.45	6.39	1.64
Genistein.	0.540	0.481	0.637
总异黄酮	208.	201.	207.
标记索赔异黄酮（每重）	202（26.1毫克）	203（43.3毫克）	202（189.5毫克）
标签索赔的百分比	103％	99.1％	102％

每个样品中的三种葡糖苷化合物被测量高于高校准标准。因此，基于测试的曲线范围的线性和LC 300 PDA检测器的已知宽线性范围提供外推值。

结论

这项研究揭示了如何PerkinElmer LC 300 18K UHPLC系统具有PDA检测的快速，鲁棒色谱分离和大豆异黄酮的定量，包括葡糖苷，乙酰甘油酯和丙糖苷缀合物。

结果表明了卓越的保留时间可重复性，以及测试的浓度范围内的卓越线性和再现性。

样品与膳食补充胶囊中的大豆异黄酮的USP Isoflavones系列，分析结果符合每个样品的标签要求。

该方法产生大多数分析物的LOQs≤0.03μg/ ml，比三个样品中任何分析物检测到的水平低四倍。

参考

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2. 安徒生JW，Johnstone Bm，Cooke-Newell Me。大豆蛋白摄入对血清脂质的影响的荟萃分析。n engj med。1995年; 333：276-281。
3. Baum Ja，Teng H，Erdman JW JR等。长期摄入大豆蛋白质改善了血脂谱，并增加了高胆固醇，绝经后妇女的单核细胞低密度 - 脂蛋白受体信使RNA。AM J Clin Nutr。1998年; 68：545-551。
4. Marini H，Minutoli L，Polito F等人。植物雌酮植物对骨质增生女性骨代谢的影响。安实习生。2007; 146：839-847。
5. Sathyapalan，Thozhukat等人。“大豆植物雌激素补充对亚临床甲状腺功能减退症患者甲状腺状态和心血管风险标志的影响：随机，双盲，交叉研究。”临床内分泌杂志杂志＆;新陈代谢，Vol。96，没有。5，2011，第1442-1449页，DOI：10.1210 / JC.2010-2255。
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7. Collison，Mark W.，高性能液相色谱紫外检测测定膳食补充剂，补充成分和大豆食品中的总大豆异黄酮的测定：协作研究。J AOAC INT。2008;91（3）489- 500.在线访问2020年3月。
8. Daems，Frederic，分析方法用于量化牛奶中的异黄酮：审查。乳房SCI。＆Technol。2016 96：261-283。

此信息已采购，从PerkinElmer食品安全和质量提供的材料进行审核和调整。亚博网站下载

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