LC/MS/MS方法分析水稻中多种残留农药

大米是世界上最常见的食物之一。在水稻生产中，广泛使用农药来防治病虫害和杂草，以提高作物产量。由于立法、天气和生产制度的差异，水稻作物使用的农药通常是国家/地区特有的。

大米中的农药残留不仅影响大米的质量，而且危害广大消费者的健康。为了避免不必要的健康风险，跟踪和管理大米中农药的存在和水平至关重要。

美国、中国、印度、日本、巴西和欧盟等许多国家都制定了包括大米在内的食品和饲料的农药最大残留水平(MRLs)。^1－3

欧盟对大米中农药残留的最大残留限量一般在10µg/kg至8000µg/kg之间。¹为了识别水稻中低水平的农药，需要高灵敏度、高选择性和高准确度的分析方法。

由于水稻生产中有可能使用大量农药，因此采用多残留法一次性测定多种农药是最有效的方法。

农药残留分析主要采用气相色谱/质谱联用(GC/MS)方法，^4、5但对于离子和极性化合物，特别是在气相色谱注射端口热不稳定的化合物，气相色谱不是一种合适的技术。液相色谱串联质谱法

LC/MS/MS是目前农药分析的首选方法，因为它具有高的选择性和灵敏度，并且适合于不同样品基质中的各种化合物。^6－10

QuEChERS萃取法已广泛应用于大米等食品样品的多种残留分析。^{4、8、9、10}本研究将改进的QuEChERS萃取法与LC/MS/MS相结合，建立了一种快速、灵敏、选择性的大米样品中200多种农药残留分析方法。

在QSight中利用时间管理的MRM™^®三重四极质谱计，可为目标分析物自动生成众多MRM跃进的理想停留时间。

这节省了方法开发的时间，提高了数据质量和分析性能，如本研究中大米样品中多种残留农药的分析结果所示。

实验

硬件/软件

使用PerkinElmer UHPLC系统进行农药色谱分离，使用PerkinElmer QSight 220双电离源三重四极杆质谱检测器完成分析物的测定。所有仪器控制、数据采集和数据处理均使用Simplicity 3Q™软件进行。

方法

样品制备:农药标准品由ULTRA获得^®科学(北金斯敦，RI)。大米样本是从加拿大安大略省的当地杂货店获得的。除了两个品牌的有机大米样品外，还检测了糙米、黑米、白米(Jasmine、Basmati、Calrose)等多种大米样品。

这些大米样本的来源国包括泰国、越南、印度、意大利和美国

大米样品的制备是按照已公布的程序进行的，该程序使用QuEChERS试剂盒(AOAC 2007.01方法)进行了微小的修改，没有分散的SPE清理。¹⁰将提取液的一(1)µL直接注入QSight LC/MS/MS系统进行鉴定。

为控制空白基质，使用有机糙米样品。通过添加浓度为10µg/kg和100µg/kg的农药，对水稻样品基质的回收率进行了评估。通过在纯溶液(乙腈)和大米样品基质(基质匹配校准)中制备8级标准品，构建了校准曲线。

通过对比从整洁的溶液和大米样品基质获得的校准曲线的斜率来评估基质效应。

为了限制假阳性和阴性的数量，每种农药至少观察到两个MRM转变。定量限(loq)是在两个转换的最小信噪比为10的基础上量化的。¹²

LC方法和MS源条件

LC方法和MS源参数如表1所示。所研究农药的多反应监测模式(MRM)转变的不完整列表见表2。

获取质谱法是通过从化合物库中选择感兴趣的农药自动生成的，该化合物库集成在simple软件的时间管理- mrm模块中，包括阳性和阴性分析物。

表1。LC方法和MS源条件。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

信用证条件
LC列	布朗利，SPP苯基己基，100 x 2.1 mm, 2.7 μm
流动相一	5毫米的甲酸铵在水中
流动相乙	5毫米甲酸铵在甲醇中
流动相 梯度	从10%的B相开始，保持1分钟， 然后在15分钟内将B增加到95%，并保持在95% B 2分钟。 最后在初始条件下使柱平衡3min。
柱温箱 温度	40°C
自动取样器 温度	15°C
注入量	1.0μL
女士源条件
ESI电压(正面)	5000 V
ESI电压(负)	-4000 v
干燥气体	140
喷雾器气体	350
源温度	325°C
HSID温度	200°C
检测模式	次MRM™

表2。MRM Transitions(被研究的213种农药的部分列表)。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

复合 的名字	极性	第一季度 质量	第二季 质量	CE	电动汽车	CCL2
乙酰甲胺磷	积极的	184.1	143.1	-12年	25	-29年
Acephate-2	积极的	184.1	125.1	-25年	25	-41年
Acetamiprid	积极的	223.2	126.1	－30	25	-49年
Acetamiprid-2	积极的	223.2	99.1	-56年	25	-73年
Azoxystrobin	积极的	404.1	372.1	-18	25	-57年
Azoxystrobin-2	积极的	404.1	344.1	-34年	25	-71年
噻嗪酮	积极的	306.2	201.1	-18	25	-47年
Buprofezin-2	积极的	306.2	116.2	-24年	25	-52年
Chlorantranilprole	积极的	484	452.8	－20	25	-66年
Chlorantranilprole-2	积极的	484	285.8	-18	25	-65年
Chlorpyriphos	积极的	350	198	－20	25	-53年
Chlorpyriphos-2	积极的	350	97	-32年	25	-64年
Clothianidin	积极的	250.1	169.1	-16年	25	-39年
Clothianidin 2	积极的	250.1	132.2	-26年	25	-48年
Cumyluron	积极的	303.1	185	－20	25	-48年
Cumyluron-2	积极的	303.1	125	-43年	25	-69年
Fenbutatin - 氧化	积极的	519.3	197	-67年	25	-112年
Fenbutatin-oxide-2	积极的	519.3	350.9	－50	25	-97年
Fenobucarb	积极的	208	152	-12年	25	-32年
Fenobucarb-2	积极的	208	95	-19年	25	-38年
Fluopyram	积极的	397	173	-35年	25	-71年
Fluopyram-2	积极的	397	145	-70年	25	-103年
Halofenozide	积极的	331.1	275	-18	25	-49年
Halofenozide-2	积极的	331.1	104.9	-25年	25	-56年
抑	积极的	297.1	201	-25年	25	-52年
Imazalil-2	积极的	297.1	159.2	-31年	25	-58年
Imidachloprid	积极的	256.2	175.2	-26年	25	-49年
Imidachloprid-2	积极的	256.2	209	-18	25	-42年
Isoprothiolane	积极的	291.1	231	-16年	25	-44年
Isoprothiolane-2	积极的	291.1	189	-28年	25	-54年
马拉松	积极的	331.1	127.1	-22年	25	-53年
Malathion-2	积极的	331.1	99.1	-24年	25	-55年
甲胺磷	积极的	142	124.9	－20	25	-32年
Methamidophos-2	积极的	142	94.1	－20	25	-32年
胡椒基丁醚	积极的	356.2	177	-13年	25	-47年
增效butoxide-2	积极的	356.2	119	-37年	25	-69年
甲	积极的	306.1	164.1	-28年	25	-56年
Pirimiphos-methyl-2	积极的	306.1	108.1	－40	25	-67年
Profenophos	积极的	375	304.8	－50	25	-75年
Profenophos-2	积极的	375	346.8	-42年	25	-113年
Propiconazole	积极的	342.1	159.1	-42年	25	-72年
Propiconazole-2	积极的	342.1	69.1	-26年	25	-58年
Tebuconazole	积极的	308	70	－30	25	-58年
Tebuconazole-2	积极的	308	125	－50	25	-76年
Thiamethoxam	积极的	292	181	-28年	25	-54年
Thiamethoxam-2	积极的	292	211	-18	25	－45
三唑磷	积极的	314.1	161.9	-22年	25	-51年
Triazophos-2	积极的	314.1	118.9	－50	25	-76年
Tricyclazole	积极的	190	163	-28年	25	-44年
Tricyclazole-2	积极的	190	136	-36年	25	-51年
Trifloxystrobin	积极的	409	186	-26年	25	-64年
Trifloxystrobin-2	积极的	409	206	－20	25	-59年
Fludioxonil	负	246.6	125.9	40	-25年	60
Fludioxonil-2	负	246.6	179.9	39	-25年	60

结果与讨论

食品样品中多种残留农药分析面临的挑战

由于本研究中所研究的农药同时含有极性和非极性化合物，因此采用有机溶剂乙腈从样品基质中提取所有分析物。然而，在反相LC方法中，在LC运行的开始使用一个水流动相，以保存柱上的极性化合物。

在LC上注入更大体积的有机溶剂，如乙腈样品提取物，会导致早期洗脱极性化合物的色谱峰减少。

为了解决这个问题，本研究中注入了少量的样本量。标准MRM方法的发展不适合分析大量的分析物，如在一次运行中数百个农药残留。手工输入所有质量转换到方法中既费时又费力。

每次过渡的停留时间不能简单地使用常规方法进行优化。因此，本研究将时间控制MRM应用于方法开发，以提高方法的效率、数据质量和性能。

由于食品样品基质的多样性和复杂性，在开发LC/MS/MS方法时，样品基质效应是首要考虑的问题，特别是在食品分析中。

已经使用了各种方法来克服样品基质效应，包括样品稀释、使用稳定同位素内标、基质匹配校准、标准添加、样品清理、使用高效色谱柱进行更好的分离，以及使用替代电离源。¹¹

在本研究中，通过比较在溶剂(纯溶液)中制备的标准品的校准曲线斜率(X)和在大米样品基质中制备的标准品的校准曲线斜率(Y)来评估样品基质效应。样本矩阵效应(%)可以通过斜率之间的百分比差来量化，即(Y-X) × 100/X。

图1所示。乙酰甲胺磷(A)、毒死蜱磷(B)、丙环唑(C)、三环唑(D)的标定曲线
(分析物浓度范围从0.1到200 ng/mL)。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

图2。乙酰甲胺磷(A)、毒死蜱磷(B)、丙环唑(C)和三环唑(D)的校准曲线(分析物浓度范围为0.1 ~ 200 ng/mL)图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

当两条曲线斜率差的百分比为正值时，表示信号增强作用，负值表示信号抑制作用。如表3和图1和图2所示，样本矩阵效应是复合依赖的。

例如,一些农药如乙酰甲胺磷和丙环唑，表现为信号放大(正值)，而毒死磷和三环唑等表现为离子抑制(负值)。

如表3所示，大多数待评价农药的样品基质效应均小于20%，因此使用整洁的溶液绘制的校准曲线进行定量，不存在明显误差，符合欧盟法规要求。¹²

而毒死磷(-55%)和戊康唑(-18%)的离子抑制作用较严重。因此，为了绕过基质效应并限制分析结果的任何变化，在整个研究中，基质匹配校准被用于所有分析物的定量。

表3。对大米样品中最常用农药的保留时间、回收率、重现性(%RSD)、基质效应和线性度进行了测定。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

农药	保留 时间(分钟)	(% %复苏相对标准偏差) 10μg /公斤	(% %复苏相对标准偏差) 在100μg /公斤	矩阵 效果(%)	相关 系数(R2）
乙酰甲胺磷	1.88	101.1 (11.8)	81.9 (4.3)	14．0	0.9997
Acetamiprid	8.15	106.5 (2.6)	98.7 (2.3)	2．7	0.9996
噻嗪酮	15.05	103.3 (2.9)	98.8 (3.5)	-3.1	0.9996
Chlorpyriphos	15.54	109.6 (10.4)	98.7 (5.0)	-55.0	0.9991
Clothianidin	6.70	105.7 (5.9)	111.2 (8.6)	17.0	0.9995
Cumyluron	12.74	98.9 (7.2)	96.1 (2.5)	-2.6	0.9984
Fenbutatin-oxide	16.90	69.5 (18.6)	78.8 (12.7)	13．1	0.9997
Fenobucarb	11.20	101.6 (2.9)	94.8 (1.9)	2．6	0.9976
Fluopyram	13．00	104.8 (3.6)	101.1 (3.1)	-2.7	0.9991
Halofenozide	12.26	89.4 (15.2)	88.3 (11.4)	-4.4	0.9980
抑	14.33	89.6 (13.6)	95.3 (4.1)	-6.1	0.9996
吡虫啉	7.57	77.5 (10.8)	112.2 (7.9)	-5.7	0.9991
Isoprothiolane	13.01	111.5 (2.7)	101.1 (2.3)	-0.4	0.9983
马拉松	13.25	92.0 (12.0)	86.0 (4.3)	-9.9	0.9995
甲胺磷	1.41	82.8 (10.1)	76.4 (14.3)	13.3	0.9978
胡椒基丁醚	15.26	106.0 (5.0)	105.2 (3.4)	-6.3	0.9977
甲	14.71	107.5 (3.7)	98.8 (5.3)	-0.1	0.9997
Profenophos	14.82	110.7 (6.9)	103.0 (6.5)	-2.5	0.9988
Propiconazole	14.32	106.6 (7.1)	98.3 (2.8)	1．5	0.9994
Tebuconazole	13.72	102.2 (6.9)	104.2 (5.5)	-18.9	0.9993
Thiamethoxam	6.43	116.4 (10.0)	114.0 (14.9)	1．9	0.9991
三唑磷	13.46	117.8 (5.7)	99.5 (3.0)	2．7	0.9979
Tricyclazole	9.27	84.2 (5.8)	80.7 (7.8)	-7.5	0.9998
Trifloxystrobin	14.91	106.7 (2.4)	106 (4)	-5.8	0.9991

方法的性能

由纯溶液和大米样品基质(基质匹配校准)制成的所有校准曲线都显示出良好的线性关系(0.1至200 ng/mL)，相关系数(R²)大于0.99(校准曲线的基本示例见图1和图2)。

在10 μg/kg和100 μg/kg两个浓度水平上测定农药的回收率。

如表3所示，大多数被研究农药的回收率在70% ~ 120%之间，RSD <20%。定量限(loq)是通过考虑定量词和限定词离子(S/N > 10)的信号确定的，并确保产品离子比在预期的20%的公差窗内。¹²

大多数被检测的农药残留限量为0.5 - 20µg/kg，远低于欧盟的最大残留限量。

样品分析

将所建立的方法用于各种食品样品的农药残留分析，包括11份大米样品;一份小麦样品和一份蔬菜吸管样品。

图3。从糙米样品中测定的农药(S10):噻虫嗪(1)，噻虫胺(2)，吡虫啉(3)，啶虫脒(4)，三环唑(5)，异丙硫烷(6)，三唑磷(7)，戊康唑(8)，咪唑利(9)，丙环唑(10)，丙酚磷(11)，三氯菌酯(12)，噻虫嗪(13)，毒死磷(14)。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

图3显示了从糙米样品中鉴定和定量的农药重叠MRM色谱图。表4记录了11份大米样品中鉴定出的农药残留，EU最大残留量为µg/kg (NA*;使用该方法也发现了一些不属于欧盟最大残留限量清单的农药)。

如表4所示，由于样品4 (S4)和样品10 (S10)生长在同一地区，样品4 (S4)和样品10 (S10)测定的几种农药相当相似，这意味着，由于该地区的法规和天气条件，在整个生产过程中对水稻作物使用的农药是特定区域或国家的。

表4。11份大米样品(S1 ~ S11)农药残留测定，μg/kg。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

农药	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10	S11	推广
乙酰甲胺磷				2．0								10
Acetamiprid							0．3			0．8		10
噻嗪酮				9．1						46.5		500
Chlorpyriphos				0．5	0．3		1．4			8．7		50
Clothianidin				7．0						3．0		500
Fenobucarb				4．1								NA *
Fluopyram					0．5							10
Halofenozide						5．0						NA *
抑	1．4			2．5		4．6				2．6	1．6	50
吡虫啉				2．8			1．1			9．2		1500
Isoprothiolane				4．4	９．３		2．9			14．7		5000
马拉松							1．8		2．2			8000
甲胺磷				0．5								10
胡椒基丁醚		０．６	1．3					0．8				NA *
甲			1．4									500
Profenophos										5．2		10
Propiconazole				8．3	8．4	6．7	4．1			18．1		1500
Tebuconazole				5．9	5．2		0．9			12．0		1000
Thiamethoxam				10．6						11．0		10
三唑磷				０．６			0．5			17.6		20.
Tricyclazole			16.4	5．8	7．6	20．6	０．６			40.2		1000
Trifloxystrobin										1．6		5000

NA*:未列入欧盟最大残留限量数据库的农药，但可用本方法测定。

结论

通过耦合UHPLC系统QSight 220四倍质谱仪建立了液相色谱-质谱联用仪(LC/MS/MS)分析水稻中多种农药残留的方法。

该方法可用于水稻中200多种农药残留的定量分析，其定量限均远低于规定限量。

时间管理的mrm模块简化了质谱法的生产，为食品样品中许多分析物的评价提供了理想的停留时间。

QuEChERS样品提取方法的回收率为70 ~ 120%，重现性(RSD 0.99)良好。

对11份浓度在欧盟最大残留限量(MRLs)或以下的大米样品建立并定量了各种农药残留。

这种LC/MS/MS方法也被用于其他食品的分析，如小麦和蔬菜秸秆样品具有良好的性能。该方法易于用于多分析物的筛选和定量，为大米和其他食品样品中农药的分析提供了一种成本效益高的单一方法。

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