食物过敏是一个日益严重的健康问题，因为它们在全球范围内变得越来越普遍。1
作为对这一增长的回应，欧盟委员会(EC)发布了第1169/2011号法规。2它列出了一份清单，列出了14种致敏成分，这些成分在有意添加到食品中时，都需要在相关的食品标签上标明。3.
美国通过2004年的食物过敏原标签和消费者保护法案（Falcpa），这是一个概述了八个主要过敏性食物的行为，称为“大8”。4.澳大利亚和加拿大每种调节12种过敏性食物，而中国调节11和日本七。5.
虽然有意加入到食品中的含量以提高各种特征，但也存在交叉污染的风险。
在加工各种食品的食物链中，这是一种潜在风险，而食品部门尚未制定严格的风险评估战略。6.
目前，立法没有处理交叉污染导致的意外过敏原的存在。为了保护消费者的健康，各国都对几种过敏原制定了自己的行动水平。
例如，澳大利亚的过敏原局提出了自愿偶然痕迹过敏原标签（重要）方案。这使食品部门的过敏原风险评估过程通过为各种过敏原制定参考剂量，包括牛奶，鸡蛋，花生，树螺母和大豆。7.
为了保护消费者对故意或无意中对过敏剂污染食品的过敏反应的风险，随着时间的推移已经开发了一系列用于食品过敏原的敏感过敏原的分析方法。
这些方法可以分为两个主要类:
-
靶向过敏性成分特征蛋白的方法
-
方法是利用标记物或DNA序列来表明引起过敏的食物的存在
第一类包括最普遍的分析方法，酶联免疫吸附试验（ELISA）。这些利用特定抗体作为物种特异性过敏原蛋白的检测的一部分。
虽然这种检测可能提供高度的敏感性和特异性，但它们在很大程度上依赖于抗体识别的表位。
然而，表位可能受与其他物种的交叉反应性的影响。食物基质的某些组分可能妨碍在ELISA测试中进行的吸收测量。
第二类分析方法是通过PCR扩增和检测特定基因序列编码的过敏原蛋白或物种特异性DNA标记。
虽然DNA是一种非常稳定的分子，但烹饪、烘焙或烘烤食物(热处理)会导致DNA提取率降低，DNA完整性受到损害。
高度加工的食品，例如卵磷脂、明胶、植物油或淀粉，几乎不含DNA。这对PCR检测来说是一个挑战。
最近几年，质谱(MS)方法越来越多地被认为是识别过敏原的可靠的多靶点方法。质谱通过检测特异性和原型特征肽，有助于高度确定过敏原污染物。
在过去的几十年里，利用液相色谱(LC)与各种质谱分析仪的耦合，已经发展了几种方法。这些系统采用高分辨率的标记肽发现系统和三重四极杆质谱仪进行定量。8.
一种基于质谱的方法能够在一次运行中检测一系列过敏原，其同步和验证是最近欧洲项目的关键目标之一。9.
因此，本文概述了使用QSight的目标方法的性能®220液相色谱三重四极杆质谱(LC-MS/MS)。
这篇文章着眼于同时定量的鸡蛋和牛奶过敏原存在于热加工面包产品，饼干。
将概述内部验证结果，保持AOAC方法检测和定量食品过敏原的性能要求，符合当前提议的VITAL阈值。
本实验
标准和试剂
开发的方法主要是利用天然合成的多肽。由于鸡蛋和牛奶作为过敏原已经被广泛研究，对于最可靠的肽标记物的审查和鉴定已经建立了共识。9.
通过Genscript合成所选择的定制标记肽序列并被双螺旋分布（表1）。
表1。优化了所有肽的MRM和化合物依赖参数，1牛奶和2鸡蛋标记缩氨酸，划线部分常用作缩写，量词过渡用粗体标注。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
| 蛋白质 |
标记肽序列 |
前体(m / z) |
保留时间[min] |
产品(m / z)(片段) |
ce |
电动汽车 |
CCL2. |
| αS1-酪蛋白1 |
FFVAPFPEVFGK |
692.9（+2） |
13.1±0.02 |
920.3 (y)8+）
991.4（Y.9+）
1090.4 (y)10+） |
-26
-26
-26 |
15.
17.
25 |
-168年
-168年
-172年 |
| YLGyleqllr. |
634.6（+2） |
11.98±0.01 |
658.2（Y.5＋）
771.3 (y)6 +）
991.4（Y.8+） |
-28
-28
-27 |
31
23
24 |
-124
-152
-140 |
| β乳球蛋白1 |
山丘vddealek. |
623.3 (+ 2) |
5.8±0.01 |
572.5 (y)10.２＋）
819.1 (y)7+）
1047.0 (y)9+） |
-30
-29
-30 |
34
41
45 |
-164年
-196年
-170 |
| VLV.LDTDYK |
533.2（+2） |
8.3±0.01 |
640.8（Y.5＋）
753.9 (y)9+）
853.0 (y)7+） |
-24
-22
-22 |
24
18.
22 |
-108年
－100
－100 |
| 卵清蛋白2 |
GGLEPINFQTAADQAR |
844.7 (+ 2) |
8.9±0.01 |
1007.4 (y)9+）
1121.2 (y)12+）
1331.6 (y)10+） |
-51年
－40
-35 |
50
38
29 |
-272
-380
-336年 |
| ISQ.AVHAAHAEINEAGR |
592.1 (+ 3) |
4.3±0.01 |
545.9 (y)5＋）
778.5（Y.7+）
858.9 (y)8+） |
－40
-31
-29 |
20.
42
30. |
-200年
-128
-204年 |
| Vitellogenin-22 |
掐FAEYPTYK |
671.6（+2） |
9.1±0.01 |
507.9 (y)4＋）
557.9 (y)9.２＋）
1114.9 (y)9+） |
-39
-25
-23 |
33
25 25 |
-180年
-140
-132 |
| 傻瓜ELGVEK |
479.7（+2） |
6.5±0.01 |
228.0（B.２＋）
544.8 (y)9+）
673.9（Y.9+） |
-18
-24
-21 |
24
27
27 |
-88年
-124
-120 |
每个肽的冻干粉用100mm碳酸氢铵:乙腈80:20 (v/v)重组，达到1mg /ml的浓度。
作为方法性能评估过程的一部分，用于牛奶过敏原检测的cookie参考材料(RM)来自全食品供应链协会的监测和质量保证(monqa)。亚博网站下载10.
该试剂盒包含以下样本:
-
阴性对照无谷蛋白曲奇
-
阳性对照，由干燥的脱脂奶粉（SMP）组成，具有验证的蛋白质含量
-
低浓度(3.53 mg/kg) SMP无谷蛋白饼干
-
高浓度(17.7 mg/kg) SMP的无麸质饼干
此外，还购买了一系列其他物品用于该方法，包括:
-
全蛋粉(购自Sigma Aldrich)
-
脱脂奶粉（Sigma Aldrich）
-
MS级胰蛋白酶金(Promega)
-
PD-10一次性脱盐墨盒（GE Healthcare Life Sciences）亚博老虎机网登录
使用C18盒（50mg / 1mL）进行样品清理。
样品制备
这两种饼干(脱脂奶粉和全蛋粉)和不含过敏原(取代过敏原成分)的饼干都是按照内部协议制作的。11.参考材料以配料的形式亚博网站下载被适当地加入到烘焙过程中。
图1。实验工作流程，用于同时检测饼干样品中的牛奶和蛋清液（从莫纳西等）。）12.．图像信用：PerkinElmer食品安全和质量
标有“未添加牛奶和鸡蛋”的商业饼干由Galbusera SpA提供并进行了分析。示例准备工作流程的概要如图1所示，如下所述:
-
来自碎屑样品的蛋白质（诱导，过敏原和商业）用Tris-HCl缓冲液200mM用尿素7m在9.2的pH下萃取。
-
提取液经5 μm醋酸纤维素膜过滤。
-
提取的蛋白经胰蛋白酶消化14小时。
-
通过酸化停止消化（HCl 6米）
-
在收集上清液之前，最终的消化物在1800×g以1800×g离心10分钟。
-
随后通过0.45μm再生纤维素（RC）过滤器过滤胰蛋白酶消化物。
-
作为进一步的纯化步骤，使用装载在C18 SPE塔上的1ml等分试样（以前用甲醇和50mM碳酸氢铵调节）。
-
c18保留肽用800 μl 0.1%甲酸水溶液洗涤。
-
然后用1.5ml甲醇/水（90/10 v / v）洗脱它们。
-
收集的馏分在温和的氮气流中干燥，悬浮在100 μl 0.1%甲酸乙腈:水(90:10,v/v)溶液中。
-
最后通过RC 0.45 μm注射器过滤器过滤样品。
硬件和软件
采用PerkinElmer LX50超高效液相色谱(UHPLC)系统进行色谱分离。
通过PerkinElmer QSight 220 LC / MS / MS进行检测，其配备有APCI和ESI电离源。SimpleCity™3Q软件用于所有仪器控制和数据的采集和处理。
方法，性能和评估
在0.0125 ~ 0.25 μg/ml的浓度范围内，建立了4个浓度水平的基质匹配校准曲线，每个浓度水平测量一份。这是通过在无过敏原饼干提取物的胰蛋白酶消化液中加入一定量的合成肽库存溶液来完成的。
计算插值参数对应的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为3倍和10倍，即校准曲线的线截距标准差除以曲线斜率。
食品过敏原检测的一个极具争议的方面是测量污染水平的正确尺度。这可以从作为一个整体成分的过敏原标记，到临床研究和潜在阈值水平，指的是有关过敏原的总体蛋白质含量。
利用先前的研究建立以下转换因素。
从μg肽/ml提取液中合成的肽浓度开始，逐步应用适用的转换因子，最终转化为μg总蛋白/g基质(图2)。
图2。流程图计算蛋和牛奶合成肽浓度的转化（μg肽/ ml.提取）进入总蛋白质浓度（μg小菜/G矩阵(改编自Monaci等)12.．图像信用：PerkinElmer食品安全和质量
方法根据最终报告单元对灵敏度、回收率、加工效果等分析特征和重复性、重现性进行评价。
基于100μg过敏性成分/ G基质污染水平样品的五种重复评估方法精度，用于血液中的可重复性。这是在3天内重复的，以衡量日内的日常可重复性。通过验证的参考材料仅对牛奶评估方法回收。亚博网站下载
试剂盒提供的空白样品用于生成与合成肽匹配的新的基质校准曲线。对低、高诱发样本进行分析。测定的浓度值与验证的浓度值之间的百分率被定义为方法回收率。
根据AOAC《食品过敏原检测与定量标准方法性能要求》(SMPR)对方法性能进行评价。13.
处理效果
为评价所选标记肽的食品加工效果，制备了产生的标记肽和产生的材料。亚博网站下载
所产生的材料来源于食品加工亚博网站下载前的空白原料。添加的物质是通过向加工过的空白食品基质中添加致敏成分而产生的。14.
在每种情况下，终止最终浓度为300μg过敏性成分/ g基质。发生的饼干是一种富含3000μg/ g过敏成分的饼干基质，其在面团制剂和烘焙工艺之前，用适量的无过敏原饼干基质稀释1:10。
相比之下，尖刺饼干涉及在烘烤和接地步骤后将整个蛋粉和脱脂奶粉添加到空白饼干碎片上。
生命参考剂量
这重要的系统是2007年制定的，旨在以定量、基于风险和方法的方式评估过敏原交叉污染的影响，并促进有关适当水平的预防性过敏原标识和管理的决策过程。
在消费者，工业和全球科学风险评估部门投入后，成立了至关重要的是保护对过敏原的消费者敏感的目标。
对过敏原产生不良反应的可能性取决于两个因素:用餐时摄入的过敏原蛋白的总体水平，以及个人对过敏原的敏感程度。
重要系统取决于用于进行计算的三个重要值：
-
参考量——在一个典型的进食场合中所吃的食物的份量或最大份量
-
参考剂量-总剂量，以毫克表示，低于此剂量，过敏人群中最敏感的过敏原消费者(1至5)可能发生不良反应
-
行动水平-食物中蛋白质浓度的阈值水平
一级行动意味着不需要任何预防标签。第2级行动意味着“可能包含”的标签是必需的。第3级行动意味着“包含”标签是必须的。
LC条件和MS参数设置
将10μL的最终提取物溶液注入PerkinElmer Brownlee TM验证的C18逆相分析柱上。所采用的LC条件可以在表2中看到，并且MS源设置可以在表3中找到。
表2。LX50 UHPLC参数。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
| ． |
． |
| 列 |
Brownlee Validated Aqueous C18，
150 X 2.1 mm, 3 μm(部件编号:N9303539) |
| 流动相 |
溶剂:0.1%甲酸在H2O.
溶剂B:0.1%甲酸在甲醇中 |
| 梯度 |
| 一步 |
时间(分钟) |
流量(毫升/分钟) |
％a％b |
| 1 |
0. |
0.2 |
90. |
10. |
| 2 |
17. |
0.2 |
50 |
50 |
| 3. |
17.2 |
0.2 |
10. |
90. |
| 4. |
27 |
0.2 |
10. |
90. |
| 5. |
27.2 |
0.2 |
90. |
10. |
| 6. |
44 |
0.2 |
90. |
10. |
|
| 注射体积 |
10μL |
| 温度烤箱 |
30°C |
| 自动进样器 |
10°C. |
表3。QSight ESI源参数。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
| ． |
． |
| 电离模式 |
ESI处于正电离模式 |
| 干燥气体 |
120 |
| HSID温度 |
250°C. |
| 喷雾器气体 |
300 |
| 喷涂电压 |
+ 4000 V |
| 源温度 |
400℃ |
源参数(包括温度、气体流量和位置设置)利用流动注射分析(FIA)对所制备的合成肽溶液进行了优化，以达到最大灵敏度。
在所有肽的流动注射分析中优化了复合依赖性参数 - 碰撞能量（CC），入射电压（EV）和碰撞细胞镜2电压（CCL2）转变（表1）。
结果
建立了一种高效液相色谱分离方法MS / MS分析成立，同时检测饼干矩阵中鸡蛋和牛奶过敏原的存在。优化了确保肽分离的色谱条件。
研究了峰值分辨率和整体运行时间之间的最佳平衡。
利用合成肽对方法进行优化，并对所选的标记肽进行筛选。在调整和流动注射分析阶段，选择了三个最强烈的多重反应监测过渡。
方法优化
为了验证基体背景中没有干扰峰，制备了空白饼干样品。这是按照样品制备规程进行的。
在样品中加入固定浓度的合成肽。在最佳分离条件下得到的具有代表性的色谱图如图3所示。平均峰保留时间也显示。
图3。在饼干基质中记录的代表性总离子色谱图（TIC），肽浓度为0.166μg/ ml。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量
方法性能参数线性，LOD和LOQ
在0.125 ~ 0.25 μ g/mL范围内，与R呈良好的线性关系2> 0.999。利用这些校准曲线，对应于插值参数的LOQ和LOD分别确定为3倍，10倍，线路截距的标准偏差除以斜率。
对检测到的过渡的LOD / LOQ值进行彻底评估促进了最佳量化标记的识别及其最敏感的过渡（表4）。
利用转换因子，从基质匹配校准曲线的值，在µg肽/mL提取物的值重新计算到µg总蛋白/g基质。随后的每个性能参数都与它们有关。
为牛奶过敏原达到低至0.1和3μg/ g的强大含量，分别被称为α1-酪蛋白（FFV）和β-乳酰键蛋白（TPE）肽。
分别用于卵烧蛋（ISQ）和vitellogenin - 2（NIP）肽的卵腰层0.3和3μg/ g。在图4中可以在0.125μg/ ml的最低校准点处看到四个鉴定的标记肽的量化器和Qualifiers的典型色谱图。
图4。在Cookie矩阵中获得的典型色谱图：XIC的量子eR过渡到最敏感的牛奶（a - ffv; c-tpe）以及它们相关的Quali er转换（b - ffv; d - tpe）和鸡蛋Quantifi ER过渡（E - ISQ; G - NIP）;限定符转换(F - ISQ;H - NIP)，均为0.0125 μg/mL。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量
方法验证根据生命阈值
新的分析方法需要良好的敏感性，以便遵守或克服重要计划中规定的行动水平。
随着临床研究可获得新的过敏性数据，这些动作水平定期修改。从重要计划3.0版本的最新价值观于2019年10月修订并随后发布。
鸡蛋和牛奶的参考剂量相同，总蛋白质为0.2毫克。饼干的份量估计为50克，结果(符合行动级别1)总蛋白质为每公斤4毫克。
值得注意的是，不仅通过该方法获得的敏感性不仅符合规定值，而且还能够检测到最小量的过敏原（比动作水平低约13-40倍）1预计蛋和牛奶蛋白分别）。
精度
评估了分析方法的日内和日期的血液准确性，以评估该方法在同一实验室内的方法（表4）的再现性和可重复性。
表4。性能参数的方法。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
| 过敏的成分:蛋白质 |
标记 |
过渡 |
LOD /定量限(μg小孩防/ g矩阵） |
R.2 |
RSDr %
n = 5.
第1天 |
RSDr %
n = 5.
第2天 |
RSDr %
n = 5.
第3天 |
RSDr % |
| 牛奶:αS1-Casein |
FFV |
692.9 / 991.4 |
0.1/0.3 |
1.0000 |
2 |
1 |
6. |
4. |
| 牛奶：β-乳糖蛋白 |
山丘 |
623.3 / 572.5 |
3/8 |
0.9992 |
8. |
9. |
10 9 |
| 鸡蛋:卵清蛋白 |
ISQ. |
592.1/858.9 |
0.3 / 1 |
1.0000 |
2 |
5. |
2 |
4. |
| 鸡蛋：Vitellogenin-2 |
掐 |
671.8/557.9 |
3/9 |
1.0000 |
3. |
3. |
4. |
6. |
在五个独立的重复和每种情况下测定血液内重复性（RSDR），所得值始终低于10％。相比之下，日期间重复性（RSDR）在3天内测定，分析相同的强化样品。
鸡蛋和牛奶定量肽在每个实例中的所得值均低于9%。采用95%置信水平的单因素方差分析(one-way ANOVA)检验比较不同天数的平均值。结果表明，各肽标记物无显著差异。
加工效果评价
比较两种类型的样品，以评估对每种牛奶和蛋肽标志物的检测的可能食品加工作用：
-
添加了过敏原的样品，在烘焙和研磨过程后，将粉状的过敏原成分添加到空白饼干中
-
在面团制剂和烘焙过程之前加入过敏成分的诱发样品
结果明显表明，食品加工可以影响对每种正在研究的过敏原成分所选择的标记物的检测(图5)。
图5。烘烤对牛奶和鸡蛋过敏原蛋白型肽检测能力的影响，通过比较在300 μg过敏原成分/gmatrix水平下产生和添加的曲奇中检测标记肽的峰值面积来计算。对于每个肽段/过渡段，信号抑制的百分比都有报道。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量
对加工效果的计算表明，牛奶多肽对烘烤的敏感性最高，峰面积减少了50%以上。相比之下，卵多肽表现出抗性，峰值减少17% ~ 26%。
真实
由于目前在烘焙食品中缺乏鸡蛋过敏原的参考资料，对其真实性的评价仅限于牛奶过敏原。亚博网站下载
将产生的样品中的每一次和高（3.54μg/ g）和高（17.7μg/ g）一式三份分析。它们还通过整个样品制备程序以及参考（无过敏原）饼干样品。
利用实验值与理论值的比值，对牛奶过敏原的方法回收率进行了估算。
用YLG肽计算的方法回收率分别在低浓度和高浓度水平下为57±6％，56±7％。在低浓度和高浓度水平下，发现使用FFV肽计算的回收率为57±4％和50±3％。
遵守AOAC SMPR 2016.002
方法性能按照AOAC指南(SMPR 2016.002)中使用质谱法检测和定量过敏原的最低性能特征进行评估。
表5中可以看到每个参数获得的结果的概述。
表5所示。方法性能与AOAC SMP 2016.002规定的食品中过敏原检测的最低要求的比较资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
| 范围 |
AOAC方法性能要求 |
这个方法 |
| 全蛋 |
牛奶 |
全蛋 |
脱脂牛奶 |
| 分析范围（PPM）* |
10 - 1000 |
10 - 1000 |
4-90 |
4-80 |
| MQL (ppm) * |
≤5 |
≤10. |
2 |
0.9 |
| MDL（PPM）* |
≤1.65 |
≤3 |
0.7 |
0.3 |
| 复苏,% |
60 - 120 |
60 - 120 |
附加说明 |
57±4 |
| RSDR., % |
≤20. |
≤20. |
≤5 |
≤6 |
| RSDR., % |
≤30. |
≤30. |
≤4 |
≤4 |
*报告为食品商品中的目标过敏原PPM，即饼干中的25ppm的“整个鸡蛋”。
为了提供比较的基础，将定量卵和标记肽的LOQ和LOD重新转化为μg过敏性成分/ g基质。开发的方法符合所有指定要求。在饼干矩阵中的鸡蛋和牛奶过敏原达到了非常具有挑战性的Loqs和Lod。
样品测量
将该方法应用于从标记为“制备的不含牛奶和鸡蛋”的各种商业上可获得的饼干获得的样品。根据该方法的敏感性，这是为了评估真正没有任何卵和乳过敏原的证据。
鸡蛋和牛奶定量肽的可定量峰面积未检测到。这表明，在所开发的方法的灵敏度范围内，这些样品没有可检测到的意外污染。
结论
本文选取具有代表性的复合食品基质曲奇饼，采用PerkinElmer QSight 220对其中鸡蛋和牛奶过敏原进行了LC-MS/MS检测。
为牛奶和蛋清剂发现LOD和LOQ的极具挑战性的价值，促进了低于（动作级别1）参考阈值的污染水平的检测，在重要计划中为牛奶和鸡蛋（3.0版）而被布置出来的参考阈值。
内部验证程序所提供的分析特性符合AOAC SMPR 2016.002指南中规定的食品中过敏原检测的最低要求。
QSight 220 LC/MS/MS满足成功检测和定量过敏原所需的灵敏度和选择性。
关于该报告的其他信息可从相应发表的同行评议论文中获得。12.
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Mattarozzi m;食品过敏原分析中食品加工影响的方法开发和验证中产生的材料的作用。亚博网站下载中国生物医学工程学报，2019,39(4):531 - 534。https://doi.org/10.1007/s00216-019-01642-3．
致谢
制作材料最初由Elisabe亚博网站下载tta De Angelis Rocco Guagnano, Rosa Pilolli，和Linda Monaci来自美国国家科学研究中心食品生产科学研究所;亚博老虎机网登录PerkinElmer公司的Aristide Ganci和Ignazio Garaguso。
这些信息来源于PerkinElmer食品安全和质量公司提供的材料。亚博网站下载
有关此来源的更多信息，请访问PerkinElmer食品安全和质量。