四环素抗生素（TCS）是动物生产领域最常用的抗生素之一。他们用于避免在动物，治疗疾病和保护动物生长中感染。
过度使用动物发起食品抗生素（例如，牛奶和肉类）会导致残留的违法行为，造成的风险对消费者的健康。四环素食品中的残留物可能会导致一系列问题，包括:
-
对细菌有抵抗力，细菌可能会传染给人类
-
毒性的风险
-
副作用
-
过敏反应
为了减少风险和保障消费者健康，全球监管机构在食品中举办了可接受的兽药水平准则。在美国，中国，加拿大和欧洲联盟的这些水平称为“容忍”，称为“最大残留水平”（MRLS）。1,2
利用高度敏感和选择性的技术，按照规定的监管要求准确监测四环素水平，是保护消费者健康的一个关键因素。
本文概述了一种UHPLC/MS/MS方法，该方法提供了肉制品中四环素类药物定量分析所需的速度和灵敏度。
为了提高测试实验室的效率，QS-Works高吞吐量自动进样器用于以下原因：
-
容量大
-
它具有温度控制的托盘
-
它利用机械臂，允许长期无人使用
-
它允许在一个序列中分析多达600个样本
该方法概述的表现出色的灵敏度，回收率，精密度，分析肉制品四环素在设置了由世界各地的不同监管部门的低公差等级所需的线性度和选择性。
这个实验
一系列的硬件被用来进行分析。用PerkinElmer QSight进行色谱分离®LX50 UHPLC系统。在检测过程中，使用一个完成珀金埃尔默QSight®420个MS / MS检测器。
采用了高容量的QS Works自动取样器，提高了实验室的生产率。采用Simplicity 3Q™软件平台进行数据采集、处理和所有仪器控制。
LC方法和MS源条件
MS源参数和LC方法见表1。表2显示了四环素类化合物的多反应监测模式(MRM)转变。
表1。LC方法和MS源参数。来源：珀金埃尔默食品安全和质量
| LC和MS条件 |
| 移动相 |
水（含有0.1％的草酸） |
| 流动相B |
乙腈(含0.1%甲酸) |
| 列 |
PerkinElmetQuasar SPP农药，100×4.6毫米;2.7μm，（n9306880）mm |
| 柱温 |
20°C |
| 自动进样器温度 |
20°C |
| 注入量 |
5μL |
| ESI电压（正） |
5100 V |
| 干燥气体 |
120 |
| 喷雾器气体 |
250 |
| 源温度 |
350°C. |
| HSID温度 |
250°C |
表2。MRM转换。来源：珀金埃尔默食品安全和质量
| 复合名称 |
前体离子/ Da |
产品离子/ DA |
CE / V |
电动汽车/ V |
CCL2 / V |
| 土霉素 |
461.3. |
426.3
201.2 |
-21
-49 |
31
25 |
-136
-180 |
| 四环素 |
445.3. |
410.3
427.3 |
-22
-15 |
29
27 |
-144
-124 |
| 金霉素 |
479.2. |
154.0
444.2 |
-34
-25 |
26
29 |
-136
-164 |
| Doxytetracycline |
445.3. |
154.1.
154.0 |
-35
-34 |
29
26 |
-140
-136 |
每个分析物至少监测两个MRM转换。这是为了降低概述方法中假阳性和阴性的数量。
的MS / MS参数的优化，包括母离子和子离子，入口电压（EV / CCL2）和碰撞能量（CE）的选择是通过标准输注完成。
通过用LC流量输注纯净标准的T-ineation，通过基于这些优化条件建立的采集MS方法来实现源条件的优化。
标准和样品制备
利用的所有试剂，溶剂和稀释剂为LC / MS级。所有四环素标准品购自Sigma-Aldrich公司采购®公司这些储存在 - 20℃的冰箱中，以防止它们的降解。
所有四环素类药物的加标和校准程序所用的库存和混合药物溶液均在甲醇中制备。为了降低标准降低的风险，所有的工作标准和库存标准都被储存在冰箱里，直到需要的时候。
在程序中使用的均质样本创建如下:
-
有代表性的肉样本被切成小块，然后混合。
-
将10克等份的均化肉类样品和8ml 0.1M水性EDTA水溶液置于50ml离心管中并涡旋。
-
随后将17ml乙腈测量载入相同的管中并涡旋。
-
将离心管放入冰柜中，冰柜在-20°C保持30分钟。
-
然后将管经过4000rpm的离心10分钟。
-
将8ml上清转移到50ml干净的离心管中。
-
加入5ml己烷去脂样品。
-
该管涡旋3分钟。
-
然后将溶液以4000rpm离心一分钟。
-
所述3毫升下层相被转移至新的15毫升离心管中。
-
它然后通过在50℃的温度下在其上吹氮气它蒸干。
-
干燥的提取物溶解在1毫升的甲醇:水(30:70,v/v)溶液中，其中含有0.01 M草酸。
-
在注射到LC / MS / MS系统之前，通过0.2μMPTFE注射器过滤器涡旋并通过0.2μMPTFE注射器过滤。3.
结果与讨论
本文旨在评估与四环素的肉样品中确定一个有效的样品制备过程中的高容量QS-工程自动进样器的性能。
使用高通量自动采样器，例如，QS-Works，可以提高测试实验室的生产率和效率。
QS-Works允许食品测试实验室处理大量样品，更快速地处理样品，同时由于其机器人取样单元，提高数据质量和一致性(图1)。
图1所示。QS-Works autosampler。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
通过利用健康加拿大卫生加拿大或美国FDA（表3中的X）的食品中为紫外线的最大残留水平（MRL）来确定参考目标水平。
表3。的保留时间的结果，基体效应（ME），线性，恢复和再现性（％RSD）。来源：珀金埃尔默食品安全和质量
| 复合名称 |
电平（纳克/克）公差（x）的 |
RT(分钟) |
我(%) |
线性度（R2） |
恢复（％） |
用草酸（％）（N = 5）RSD |
RSD无草酸（％）（N = 5） |
| 土霉素 |
200 |
3.09 |
86. |
0.9984. |
70.0 |
4.6 |
11.0 |
| 四环素 |
200 |
3.26 |
80 |
0.9997 |
116.0 |
4.9 |
16.0 |
| 金霉素 |
200 |
3.65 |
96. |
0.9991 |
87.3 |
1．9 |
9．5 |
| Doxytetracycline |
200 |
3.73 |
94. |
0.9980 |
71.6 |
1．5 |
8．0 |
检测阈值，或“是/否”的筛选水平，应是在或低于0.5X。四个四环素色谱（XIC）表现出良好的峰分辨率（图2）。
图2。a)土霉素，b)四环素，c)金霉素，d)强力霉素。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
为了确认和鉴定的目的，观察到两个离子跃迁，导致鉴定的更大的选择性和特异性。每个离子比是通过计算低强度离子的峰面积和高强度离子的峰面积来确定的，从而得到离子比。
在LC/MS/MS方法发展的主要关注是样品基质效应(MEs)。由于食物样品基质的复杂性和多样性，在分析食物时尤其如此。
ESI容易受到在存在电荷竞争矩阵组分的分析物中的电离抑制。ESI中可以发生矩阵诱导的增强效果，这可能导致量化的大偏差。
为了克服样本矩阵效应，采用了一些方法，包括:
-
标准添加
-
样本清理
-
利用同位素内部标准
-
样品稀释
-
Matrix-matched (MM)校准
-
使用高效柱进行改进的分离
样品基质效应通过比较从肉类样品基质获得的校准曲线的斜率和从纯试剂(RO)获得的斜率来计算。
每个分析物的样品基质效应(以百分比表示)然后由被比较的斜率之间的百分比差来确定。
大多数化合物的基质效应小于20%(表3)。
基质匹配校准在这个分析中所有被分析物的定量被利用。这是控制矩阵效应并降低分析结果中的变化水平。
利用仅试剂（RO）和矩阵匹配（MM）标准进行校准。
由RO和肉样本矩阵构造的每个校准曲线都具有相关系数的良好线性（R.2）大于0.99。用于校准曲线的典型实例，参见图3和4。
图3。仅从试剂中制备的标准品中获得四环素的校准曲线。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
图4。从肉类样品基质中制备的标准品中获得的四环素的校准曲线。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
携带的程度是由高浓度的标准后注入试剂空白评价。没有夹带在任何测试的注意。
草酸加入到水流动相3.防止LC零件或柱体的金属离子螯合四环素。这也有助于维持良好的峰形和重现性在运行。
方法精密度好，5次重复RSD < 5%。在流动相和重组溶剂中使用草酸对重现性的影响见表3。
通过在流动相和重组溶剂中加入草酸，所有分析物的重现性和峰形都得到了改善。在肉类样品中，每种四环素的定量限(LOQ)均低于允许的容许水平。
这表明该技术符合分析肉中四环素耐受性所需的敏感性水平。
在信噪比为10的基础上估计了四环素类药物的loq。每种药物的定量限为1.5±1.0µg/L。
这些结果表明，该方法可以用于肉类样品中四环素类药物的快速筛选和定量，而四环素类药物的绝对回收率在70-120%之间(表3)。氘四环素的使用可以弥补该提取工艺对四环素类药物的损失。
结论
PerkinElmer高通量QS-Works自动进样器和lx50 UHPLC偶联到AQSight 420 MS/MS系统被用于展示一个UHPLC / MS / MS方法。
该仪器显示识别和定量均质肉类样品中的四环素的良好灵敏度。该方法中获得的低检测水平可以帮助支持日常筛选和定量分析的低监管限制。
参考文献
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最大残留物限制（MRLS）列表为食物，保健加拿大，2017年8月的食物中的兽医药物。https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/veterinary-drugs/maximum-residue-limits-mrls/list-maximum-residue-limits-mrls-veterinary-drugs-foods。访问的十一月，2020
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标准方法性能要求（SMPRS®用于筛选和识别食品中兽药残留物的识别方法。smpr2018_010.pdf（aoac.org）。访问的十一月，2020
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Aurélien Desmarchelier, Sébastien Anizan, Mai Minh Tien, Marie- Claude Savoy & Cindy Bion(2018)基于液-液萃取与低温分配的液相色谱-质谱/质谱法测定五种四环素及其上合物，食品添加剂和污染物:a部分，35:4,687-695,DOI: 10.1080/19440049.2018.1427894
致谢
从最初由萨巴·哈里里，阿比尔亚博网站下载哈立德，阿维纳什达尔米亚和秦峰PerkinElmer公司撰写材料生产
这些信息来源于PerkinElmer食品安全和质量公司提供的材料。亚博网站下载
有关此来源的更多信息，请访问PerkinElmer食品安全和质量。