SRRF流+超分辨显微术方法

受物理定律的限制，科学发现和知识的进步可以被捆绑在一系列缓慢的过程中。在显微镜中，直到21世纪初^圣世纪以来，光的衍射极限似乎是一个不可逾越的障碍。人们相信，根据物理定律，如果两个点之间的距离小于观测它们的光波长的一半，它们就不能被分辨(分离)。

实际上，这决定了在实践中光学显微镜只能分辨分离距离为200nm或以上的物体/结构。因此，由于许多亚细胞结构和细胞器都小于200 nm, 200 nm的屏障将会带来相当大的知识空白，等待被揭示。

21世纪的头十年^圣世纪，科学家和研究人员利用一系列创新的显微镜技术成功地解决了光的衍射极限所带来的障碍：一个新的发现领域正在出现。超越光的衍射极限的成像随着超分辨率新方法的发展而发展。

超分辨率显微术方法,包括;STORM/PALM(随机光学重建显微镜)/(荧光光激活定位显微镜);激发发射耗尽显微镜;和SIM(结构照明显微镜)是研究人员容易获得的技术。

超分辨率方法是一个新的发现领域，但也存在一些局限性。采集的高能量要求、复杂的样品制备程序和较长的采集时间，使该系统在尝试活细胞成像时不适合(如果不是不兼容的话)。

此外，光学标准和计算机功率要求产生成本高得令人望而却步，这使得许多实验室无法使用SR方法。

最近，旋转圆盘共聚焦技术的进展已经证明适合于活细胞成像，实现了超出衍射极限1.6倍的改进。这是通过光学过采样和计算重分配的组合实现的，然而，这是以大大减少的视场为代价的，从降低的本地分辨率开始。此外，它仍然不可避免地受到昂贵硬件成本增加的影响。

由于其创新的定制针孔间距分离和针孔尺寸，蜻蜓旋转盘共聚焦具有更高的固有轴向和横向分辨率，这种组合为常规成像提供了更高的分辨率。此外，利用光子重分配(反褶积)对获得的图像，蜻蜓的最终轴向和横向分辨率可分别达到240 nm和139 nm。

然而，问题仍然是，如果研究人员需要提高分辨率怎么办?或者，不能使用旋转圆盘共聚焦显微镜?是否有一种与实时成像兼容的替代方法，能够快速获得全视野的超分辨率图像，如果必要的话，还能深入细胞内部?当使用SRRF或SRRF- stream +时，这些问题的答案是绝对的(图1)。

图1。对比共焦成像、共焦成像与反褶积、共焦成像与SRRF-stream+。高放大倍数的特写镜头是为了更好地显示所获得的分辨率。双酚a细胞用phalloidin、moto tracker和DAP图像用Ixon 888共聚焦模式(无SRRF)和SRRF-stream+共聚焦模式。

2016年，Henriques实验室开发了一种非常规的超分辨率方法，使用一种称为SRRF的技术-超分辨率径向波动（1）。SRRF可与宽场、TIRF或共焦结合使用，最终分辨率将取决于采集数据集的特性。

利用SRRF算法，研究人员可以获得高达50 nm（1）的XY分辨率。此外，SRRF算法不需要非常规或复杂的样品制备或购买特殊荧光团，使其与标准荧光团和荧光蛋白兼容。

首先，一个超分辨率SRRF图像可以通过平均捕获20-100帧(更多帧导致更高的分辨率)获得，这种成像所需的能量大约是每厘米mW到W²的范围内。这些特性使SRRF与活细胞成像兼容，(1,2)。最初，SRRF是作为ImageJ插件提供的，为了获得SRRF图像，需要进行长时间的采集工作。因此，在Image J插件- NanoJ中对采集到的数据进行后处理，最终得到srrf图像。

图2。SRRF和SRRF流分辨率随着每个时间点获取(和处理)的帧数的增加而增加。A)分辨率随获取帧数的增加而增加的图。可以观察到，在100帧之前会有很高的增长。均值是所有径向波动相关分析的平均值(在不同的兴趣区域- ROI)。最小值显示给定ROI的最大分辨率。B1和B2)在Andor Dragonfly上使用TIRF (B1)拍摄的肌动蛋白丝，以及使用飞行中的srrf流处理(B2)拍摄的TIRF。甚至在以TIRF方式获取时也可以观察到，SRRF-Stream提供了显著的分辨率提高。

2018年，安道尔与安道尔的Henriques教授合作推出了SRRF Stream，这是SRRF算法的应用，可通过点击按钮实时生成超分辨率图像。与初始SRFF算法一样，SRRF流的分辨率将随着每个给定时间点的帧数的增加而提高。这是最突出的100帧，实现了从100帧到500帧的更稳定的增长，以及从500帧开始的相当适度的分辨率改进（图2、图3）。值得注意的是，其他因素会影响分辨率，如奈奎斯特采样、半径放大、曝光时间和光环半径增加；为了获得最佳结果，应测试这些参数。

图3。srrf流的分辨率随着每个时间点获取的帧数的增加而增加。100nm的四层微珠成像，并测量FWM。我们可以观察到，在100个SRRF帧的情况下，四倍镜珠的FMW为50 nm．使用SRRF流算法可以精确测量100 nm的珠子，并获取100帧。在共焦模式下获取图像，在共焦模式下，每个点分别使用不同的SRRF流获取图像：100、200、500、700、1000。感谢Ann Wheeler博士，爱丁堡大学MRC遗传学和分子医学研究所高级影像资源的负责人。

ANDOR的SRRF-Stream是一个显著的改进，使活细胞超分辨率，深入细胞和组织超过覆盖顶部。

SRRF流仅通过micro manager和Fusion（控制蜻蜓共焦的软件）与iXon EMCCD相机一起提供。SRRF流的好处如下（3,4）：

• 根据使用的成像模式（即共焦、宽场或TIRF）以及实验条件，通过提供最终分辨率（50-150 nm）增加2到6倍的超分辨率图像来破坏光的衍射极限
• 通过改进工作流和防止后处理的需要，实现实时超分辨率图像。
• 使用低激发功率强度成像（mW至W/cm²）．这导致了更高的兼容性，延长活细胞观察和最小的影响细胞生理学。
• 与典型荧光团和荧光蛋白相容
• 简单样品制备

因此，srrf流对于任何显微镜都是一种经济的解决方案，因为它们都可以转化为超分辨率显微镜。SRRF-stream与任何成像技术兼容，特别是共焦、宽视场、TIRF和(图4)。2020年7月，宣布对SRRF-stream算法进行进一步改进:SRRF-stream +(图1、4、5、6、7)。

图4。不同成像模式（宽场和共焦）之间的比较（带和不带SRRF Stream+Hela细胞）使用Ixon888相机在蜻蜓体内对MLKP1（红色）、a-微管蛋白（绿色微管）a和DAPI（蓝色DNA）进行染色。

在增强的径向测量中SRRF-Stream +超越了以前版本的SRRF。最初，在6个方向上计算半径测量值，而现在在24个方向上计算半径测量值（图5）。这一进步将细化超分辨率处理数据的结果，并去除周期性恒星伪影，这些伪影以前在动粒等圆形结构中特别可见（图7）。

图5。SRRF流和SRRF流中的半径计算测量+由于图像可以观察到，增加的计算半径测量将提供更准确的SRRF图像结果。

返回最佳结果SRRF-Stream +，用户仍需要根据Nyquist标准获取图像。如前所述，通过2.3或更高的因数进行过采样时，将获得分辨率方面的主要优势。然而，当过采样系数为1.5时，仍然可以使用SRRF流+产生令人满意的结果。¹

图6。SRRF Stream+提供高质量的超分辨率图像。用phalloidin（红色）、mitotracker（绿色）和DAPI（蓝色）染色的BPA细胞用Ixon 888 Ultra在共焦模式（无SRRF）和SRRF stream+共焦模式下成像。

在分析图1、图4、图5和图7中可见的插图时，SRRF Stream+的优势是显而易见的，但许多潜在用户可能仍然存在一些重要问题：采集速度如何受到影响？如果SRRF Stream+计算24个方向的半径而不是6个方向的半径，SRRF Stream+是否比原始版本的SRRF慢4倍？

图7。SRRF stream+提供高质量的数据。在非常高的放大倍数下，在特定的结构中，这样的动粒偶尔会出现一些恒星伪影。SRRF流+24个方向的半径计算消除了恒星伪影。用Ixon888 Ultra照相机在蜻蜓体内对Cenp-A（绿色动粒）和DAPI（蓝色DNA）染色的Hela细胞成像。

在开发最新的SRRF算法时，Andor认为采集速度也是许多研究者的一个重要参数。它已经有可能获得增强的图像质量与名义上的影响，采集速度。为了实现这一点，CUDA的性能已经完全最大化，利用nVidia显卡的巨大计算能力来加速SRRF-Stream+计算。因此，100个时间点，每个时间点50张srrf流+图像(相当于500张图像)的延时采集与原始srrf流只相差0.5秒。²

至于Andor的原始SRRF-Stream的优点，它们被保留在SRRF-Stream+中，但图像质量得到了增强。超分辨率成像处理仍然以快速的处理速度完成，比ImageJ SRRF快30倍(”NanoJ-SRRF”)。此外，SRRF图像采集/处理是实时捕获的，与数据的获取并行:算法生成的图像最终分辨率在50-150 nm之间。

此外，由于能量要求较低，SRRF Stream+是活细胞显微镜的理想解决方案。利用大视场可以获得超分辨率图像，关键的是，超分辨率显微镜不仅限于细胞表面事件。利用SRRF Stream+，可以在细胞或组织深处获得超分辨率图像，而无需复杂的样品制备。

随后，自推出以来SRRF-Stream，它已广泛用于各种应用。iXon摄像机（4）中使用的SRRF流示例包括：观察线粒体通过微管失稳进入细胞末端（5），或检查间充质干细胞中的HIF1α核易位。（6）蜻蜓多模式共焦系统也用于生成SRRF流图像，例子包括使用光遗传学工具研究胞质分裂（7）以及研究II类PI3K在调节网格蛋白依赖性胞饮作用中的囊泡转运分析。（8）

SRRF-Stream+的其他应用包括亚细胞器水平的蛋白质结构研究，单个SNARE蛋白机制的膜融合研究，细胞内单个分子的跟踪，以及细胞内骨架重组(肌动蛋白纤维网的改变)。

总之，SRRF-Stream算法的改进提供了活细胞兼容的超分辨率，并显著提高了结果。SRRF-Stream+生成胞内结构无伪影的超分辨率图像，补偿摄像机固定模式噪声的影响，进而提供增强的高质量超分辨率图像。

参考文献

1. 古斯塔夫松，库利，S，阿什当，G。等．利用ImageJ通过超分辨率径向波动进行快速活细胞常规荧光团纳米检查。Nat Commun12471(2016)。https://doi.org/10.1038/ncomms12471
2. Culley S，Tosheva KL，Matos Pereira P，Henriques R.SRRF：通用活细胞超分辨率显微镜。Int J生物化学细胞生物学。101:74-79 (2018).https://doi.org/10.1016/j.biocel.2018.05.014
3. 你的下一个共聚焦应该是蜻蜓的十二个理由。（2017）https://www.oxinst.com/assets/uploads/downloads/Dragonfly-Twelve-Reasons-Why.pdf
4. “SRRF-Stream”:相机中的实时超分辨率。（2017）https://andor.oxinst.com/assets/uploads/documents/srrf-stream-technical-note.pdf
5. Choi, ge, Oh, J.Y, Lee, H.J.et al。糖皮质激素介导的er -线粒体接触通过微管的不稳定减少AMPA受体和线粒体运输到细胞末端。细胞死亡说1137(2018)。https://doi.org/10.1038/s41419-018-1172-y
6. 李，h.j.， Jung, y.h.， Oh, J.Y.et al。BICD1在低氧适应期间介导间充质干细胞HIF1α核易位。细胞死亡是不同的26日,1716 - 1734(2019)。https://doi.org/10.1038/s41418-018-0241-1
7. Castillo Badillo J.A.，Bandi A.C.，Harlalka和Gautam N.光控沟渠形成的SRRF流成像显示局部和协调的内吞和外吞介导膜重塑。ACS合成器。医学杂志。9, 4, 902-919(2020)。https://doi.org/10.1021/acssynbio.9b00521
8. Aung，K.T.，吉冈，K.，Aki，S。等．II类磷酸肌苷3激酶PI3K-C2α和PI3K-C2β在人血管内皮细胞中差异调节网格蛋白依赖的胞饮作用。杂志Sci69年,263 - 280(2019)。https://doi.org/10.1007/s12576-018-0644-2．

参考资料及进一步阅读

1. 更多关于如何在Ixon相机样品的详细信息，请去安多尔原始SRRF-stream科技报告．
2. 使用Ixon Ultra获得1024 X1024的全视场图像。

这些信息都是从Andor Technology Ltd提供的材料中获取、审查和改编的。亚博网站下载

有关此来源的更多信息，请访问和或科技有限公司