欧米茄光学公司最近将其多光谱荧光检测系统改为流式细胞术。
最初为共聚焦应用生产的硬件，并且由脉冲激光激发具有反射光纤尖端的串行布置，由纤维延迟线分开。
光纤阵列的近端针孔作为共焦针孔。当这个系列中的每个光纤尖端将一个较长的波长依次反射到PMT探测器时，就会产生一个时间指数化的光谱。多达10个光谱箱由反射光纤尖端之间的波长间隔确定。
这种结构使得使用一个PMT在2.5微秒内获得多光谱数据集，可以进行光谱分离或更多处理。
激发激光器的序列光纤阵列和匹配的探测器可以放置在流动路径，最大限度地增加潜在标签的数量，甚至更远。
基于光纤的方法可以同时识别细胞内的正向和侧向散射。据估计，在非成像应用程序中，每秒可组织多达8万个单元。利用欧米茄现有的硬件，每秒成像400个细胞是可以实现的。
用共振扫描镜代替目前使用的galvo镜可以进一步提高成像率。
通过对焦和散焦可以改变空间分辨率。本文将展示分选和成像通道的初步结果，以说明这种技术将如何产生具有多个通道的紧凑和轻量级流动系统。
图1所示。基于纤维的多光谱共聚焦显微镜与NIH / NCI的SBIR授权开发。独特的检测方案由2个串联栅阵列组成，其在顺序时间点将波长频率反射到检测器，在2.5μs内构建每个像素的频谱。
图2。上图为单个光纤尖端的光谱响应。蓝色波长显示光纤损耗。整个光纤阵列的底层光谱响应。到达PMT的光是一系列以波长逐渐变长为中心的带通光。
图3。数据采集和显示过程
红色脉冲表示“开始”，并与激光器通信，后者向样品发送100纳秒的激光脉冲。在此过程中，波长箱按顺序返回检测器。原始数据的速度受到探测器的限制。
第一个垃圾箱是拒绝从红腿的“蓝腿”光。第二是空的，而箱3至12表示上面概述的波长箱。为了在脉冲之间恢复并确保检测器提供最佳响应，延迟线彼此距离距离。
将所提出的数据被处理以在通道中间移除微小数量的串扰，并构成顺序光纤阵列的非离心状态。
这些是从GUI中获得的直方图示例，描述了在488 nm处激发的几个量子点的发射光谱。对每个像素检索并处理每个容器。
数据可以通过许多不同的方式可视化。二合一光纤合成器可实时同时显示三个通道(RGB及以上)、光谱角度映射、多通道数学、单色单通道、单色(最大像素强度)。
初步结果
该系统被设计用于成像的目的，因此其目前的能力是起点。单点扫描用于确定系统的速度限制，因为当时对镜子不可用。
图4。说明了混合珠子和原始数据的痕迹，对应的红色和绿色像素从示波器。红色像素为4 μm，绿色微珠直径为2 μm。通过将RGB颜色分别赋给x、y、z容器，这些容器可以实时上色。
图5。在移动舞台时叠加连续图像。图像用RGB显示。我们手动移动舞台，同时获取序列图像，以说明系统的速度。注意，在这些速度下，形状不会受到运动的干扰。
方法 - 单点测量
使用100mm ID方石英管或拉圆玻璃管来复制流式细胞仪的检测室．
这些被环氧树脂注入注射器针头和显微镜上的载玻片，以保持稳定的调查期间。对注射器进行手动压缩，以触发管内珠子的流动。
油管内的珠子是系统的主要焦点。在此之后，扫描镜被置于中心并关闭。采用直接示波器输出，避免了软件的图像处理功能来确定系统的速度。
利用ImageJ对示波器输出(TIFF)的时间响应进行FWHM分析，测量系统中磁珠的线速度。
初始调查采用6毫米直径的6色球柱珠，用于均匀预测和信号。另外在2mmg，4mm红色和6mm球辐9珠子的混合物上进行实验。
图6。(上)单点测量示意图，(插图)安装在舞台上的流池的照片。
图7。这些是6毫米的Spherotech珠，表现出各种强度水平。6毫米珠子的理论极限是2.4米/秒，这将给每个粒子一个脉冲。电子噪声并不是出现在所有的箱子里，而是随机的峰值，允许过滤。图片来源:欧米茄光学公司
图8。1 μm绿色微珠2 μm红色微珠6 μm多色微珠。该系统可以很容易地根据尺寸和光谱组成确定珠的类型。
结论和未来方向
实验证明，a10通道，单点荧光流量仪检测系统可实现1米/秒的线性流量。
系统的速度可以根据粒度进行优化。可以对这种安排进行修改，以合并前面和侧面散射功能，如图9所示。
通过对系统的微小修改，预计10色成像检测也将达到每秒400个细胞(6 μm直径)的速度。为了实现这一点，需要修改镜像控制软件，如图10所示。
每个透视图都需要更新用户界面以优化流程。在这个系统的不断发展中，欢迎合作。
图9。通过增加一个反射器和一个光纤组合器，可以在探测阵列上增加前向和侧向散射通道。
图10。在成像模式下，一个x-镜可以用于栅格穿越细胞，同时检测反向散射方向。
参考和进一步阅读
- Carver，G.E.，Locknar，S.A.，Morrison，W.a.，Ramanujan，V.k.和farkas，D.L.高速多光谱共聚焦生物医学成像“，J. Biomed。选择。19（3），036016（2014年3月21日）。http://dx.doi.org/10.1117/1.jbo.19.3.036016
- Carver，G.E.，Chanda，S.K.，Morrison，W.a.，Locknar，S.A.和Johnson，R.L.S.MultiSpectral荧光US专利9,155,474的多光谱成像系统（2015年10月13日）
致谢
Harika Vengaladasu在数据收集、分析和海报准备方面寻求帮助。共聚焦仪器的原型是由国家癌症研究所通过NIH资助开发的(SBIR Ph. II 5R44CA124036-03)。
由欧米茄光学公司的Sarah亚博网站下载 Locknar, John Barton和Gary Carver原创的材料制作。
这些信息已采购，审核和调整欧米茄光学公司提供的材料。亚博网站下载
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