使用现场流分馏以获得高分辨率分布的纳米粒子尺寸和Zeta电位

在这次采访中，Christoph Johann，Ph.D.从Wyatt技术谈到使用现场流分馏来获得纳米粒子尺寸和Zeta电位的高分辨率分布。

你能在FFF上给一些背景吗？

FFF已经很长一段时间了，在它的验收中正在增长。这具有激励ISO与标题“使用不对称流动和离心场 - 流分馏纳米物体分析纳米技术分析”的新标准。这是使FFF一种接受和标准化的方法的迈出一大步的一步，与SEC相当。

尽管如此，FFF仍然是不易使用和需要专家来充分利用它的声誉。我在这里谈谈更广泛用户群的FFF的全新的开发。它是新仪器加上复杂软件的组合。它提供了一组关于复杂样本的全面数据，没有其他单一方法可以提供。

当你谈论一个复杂的样本时，你的意思是什么？

复杂样品是一种不是均匀的样品，而是由具有不同尺寸和性质的各种组分组成，至少一个是纳米颗粒。

它们覆盖尺寸范围从几纳米到围绕微米，它们可以在几何形状，化学成分和结构中不同。这些类型的纳米颗粒中的每一个通常具有尺寸和结构分布。yabo214

一旦添加其他大分子化合物，就像蛋白质或聚合物一样，那么你就可以获得一个尺寸和形状的动物园，一体化在一个样本中。

许多应用，包括基因递送，癌症疫苗接种，药物递送以及复杂的工业应用全部取决于复杂的样品。分析变得具有挑战性，传统方法无法提供所需信息以优化合成，并了解产品的工作方式，或者为什么不按预期工作。

是什么让fff是复杂样本的首选方法？

尺寸是纳米材料最重要的特性，使它们与较小的分子不同。亚博网站下载为了说明我们在谈论的内容，首先考虑肽，其相当小，容易被HPLC分离。然后，我们具有抗体，较大但仍然在尺寸范围内，可以通过柱子表征，如HPLC或SEC列。

当我们将其与病毒进行比较时，有一个明显的大小差异，并且列可能不是表征它们的最佳方法，因此我们需要其他东西。这就是FFF发挥的地方，因为它可以将这些大结构分开，以及在同一样品中的抗体或肽等较小的结构。

FFF在其他分离方法上有哪些优点？

FFF根据尺寸物理地将样品分开，此外，可以收集馏分。与动态光散射相比，它具有高分辨率，以及宽分离范围，并且这种组合使其成为复杂样品的强大。它温和，具有低剪切力，因此是非破坏性的。

FFF可以在线耦合到多角光散射（MAL），其提供绝对的摩尔质量和洗脱级分的尺寸。凭借我们的新发展，我们可以使用电气/流FFF确定充电和充电分布，简单升级到现有的Eclipse FFF系统。

您的新发展如何使FFF更容易和更强大？

我们集中了三个特点：无缝集成和自动化的系统;扩展数据处理能力提供摩尔质量，尺寸，形状，构象，加电荷和电荷分布;和软件支持的方法开发。

流动fff的操作方法是什么？

将样品注入薄，带状的通道中，该通道具有多孔底壁。穿过通道的一部分流向出口的流动穿过底部，产生交叉流量。这种交叉流量将样品朝向所谓的积聚壁，底壁集中。布朗运动充当反作用力，抵御积累。因此，分子不断地远离底壁，由布朗运动驱动，但它们将从上面推回上横流。在静止平衡中，这产生了一种粒子云，其具有浓度的指数降低，作为距离底壁的距离的函数。

每个粒径将具有与累积壁的平均距离不同，由其扩散系数确定。具有较高扩散的较小yabo214颗粒在通道中将升高，另一种方式更大，颗粒更大，将保持靠近堆积壁。

沿着通道的层流量产生差分流速，取决于距离墙壁的距离。较小的颗粒行进得更快，然后yabo214首先洗脱，然后是更大的颗粒，然后是较大的颗粒，导致分离。

如何使用多角度光散射（MAL）获得摩尔质量和半径？

激光束通过溶液流过的电池。光与样品中的电子的相互作用产生散射光，由探测器测量。它们围绕散射中心，并在我们的仪器中，我们有3,8或18个探测器，其将摩尔质量测量从200g / mol到10分配到10^9.G / Mol，尺寸测量从10nm至500nm的半径。具有较少角度的仪器在这些范围内具有较低的上限。

散射强度与摩尔质量和浓度成比例，并且从角度的强度降低，我们可以使用基本物理方程提取尺寸。

为了计算摩尔质量和尺寸，散射强度除以每个角度的浓度，并且数据由软件适合。从回归线的截距来看，我们得到摩尔质量，从斜坡上，我们可以计算平均方形半径。所有MALS测量的结果是摩尔质量和各个切片的尺寸。

您如何开发系统设置以允许新的和缺乏经验的用户操作系统？

这是我们称之为愿景的新软件平台。它将完整的工作流程从方法开发中集成到最终结果。所有应用程序都从本集线器启动。这包括Voyager，它是用于运行实验和SCOUT的软件，用于方法开发和用于数据处理。

开发侦察员的方法有四个步骤。首先，我们定义了一种代表我们样品的系列或一组尺寸，加上温度和溶剂。如果要运行电/流量FFF，我们还可以考虑粒子的电泳移动性。

第二步骤是选择诸如SEC信道或更长的信道和间隔物的频道几何体。

第三步是开发流程，直到我们有令人满意的分离。最后一步是将该方法导出到航行员并运行它。

模拟如何与真实实验相比？

在我们自己的例子中，协议非常出色，保留时间完美匹配。我们认为，与模拟相比，较早的尺寸尺寸的峰值峰值更广泛。也就是说，模拟假设单分散样品，而是从实验中的分数形状的形状，我们看到尺寸分布，并且MALS确认观察。

侦察员如何在运行后优化实验？

让我们在我们之前的实验中说我们希望增加两个峰之间的分辨率。它们不是完全基线分开，因此我们使用Scout运行不同的横流梯度，并预测它们将如何影响我们的压力线。我们发现改进分离的三种变化：减少初始交叉流动，在较长的时间内降低，然后在梯度末端保持更高的交叉流动。侦察兵预测，两种后期洗脱峰值将超过与此方法分开的基线。

同样，这是对模拟和实验的比较，并且在模拟和实验之间存在良好的匹配。因此，模拟真的很有用，让我们实现我们渴望的结果。

校准是可以计算FFF保留时间的尺寸分布之前的一个重要步骤。你的系统中如何完成？

校准频道参数的模拟可以通过两种方式进行。假设FFF理论完全适用于我们的样本，我们只使用一个参数，有效通道高度。第二个选项正在运行一组校准标准。Scout允许使用两个方案，并可以比较产生的大小分布。

您是否能够追踪此FFF系统中的性能？

所有数据和系统跟踪都会使用数据文件保存，可以使用SCOUT查看和比较以验证实验的有效性。

Eclipse仪器的交叉流量非常高，这对于高精度测量至关重要。如果出现问题，系统参数迹线的曲线允许我们一目了然地识别可能的问题或异常值。

来自Eclipse FFF实验可能辨别的主要参数是什么？

在绝对摩尔质量和来自MAL的尺寸的顶部，它可以从保留时间提供水动力半径。此外，通过添加电场，我们可以确定电泳迁移率值，然后可以转换为Zeta电位。电导率，pH和温度实时测量并作为数据迹线提供。

您提到将电气场应用于频道？这是如何用于确定电泳移动性的？

我们称这种方法电气/流fff。通过向流量FFF通道添加两个电极，我们能够施加与交叉流平行的电场。通过单独将样品聚焦在横流之后，我们在洗脱步骤中添加电压，其中发生分离。两个场叠加和具有电荷的样品的保留时间将改变。从保留时间的转变，计算电泳迁移率是直接的。

如果我们选择该领域的极性，使得我们对堆积壁具有吸引力，这是颗粒上的负电荷和积聚壁上的正电荷，然后保留时间将与电场强度成比例地增加。

如果我们有两个相反的电荷，我们将看到一个部分移动到缩短保留时间，并且相反的电荷移动到更长的保留时间。如果我们在几个实验中应用一系列增加的电场强度，则保留时间将与电场强度成比例地增加。

我们可以同时计算样品中的几个组件上的电荷。这是一种能力，原则上的批量测量不用使用光散射的传统Zeta电位测量。

如何使用分数来获取有关蛋白质的信息？

蛋白质电荷取决于构象，当然是pH或离子强度等溶液条件。我们可以使用EAF4，电/不对称流场流动分馏，以极少的努力测量蛋白质的负荷。

我们还具有前景的首要结果，表明我们可以使用EAF4测量的充电，作为鉴定抗体上的应力的参数，这在不一定地在变化的摩尔质量中看到。

关于Christoph Johann Ph.D.

Christoph Johann博士是Wyatt Technology Europe GmbH的创始人，并且在20多年内积极参与聚合物，生物聚合物和蛋白质分析。

他于1985年在大学的1985年赢得了博士学位。同年，他是PSS聚合物标准服务GmbH的联合创始人，该公司提供了用于研究目的的型号聚合物和开发的SEC柱。

1993年，他留下了PSS，并创立了第二家公司Wyatt Technology Deutschland，现在称为Wyatt技术欧洲。该公司已在制药行业中的多角光散射的增殖发展。