生物材料的样品制备-从细胞破碎到均质和粉碎亚博网站下载

生物样本有各种形状和大小，例如，坚韧的纤维植物、坚硬的骨头、柔软的肌肉、坚韧的黏性痰液、肿瘤或肝组织。此外，还有数以百万计的细胞状细菌、酵母或藻类，在提取蛋白质或RNA或DNA等应用中，它们必须被破坏。

由于样品制备是每个分析过程的首要步骤，所有类型的生物样品都必须为代谢组学、基因组学或转录组学的研究准备。RETSCH提供了一系列的研磨机和研磨机，用于固体样品材料的简单和可重复的粉碎，其中一些也是理想的细胞破碎和生物样品材料的均质。亚博网站下载

在本文中，RETSCH mills的使用描述了以下应用:

• 微藻、酵母和细菌的细胞破坏(悬浮)
• 低温研磨松针、细胞丸和肌肉组织
• 硬、软生物样品(如肝、痰)均质
• 从受感染的人体组织中获得完整的细菌细胞的清洗过程
• 粉碎法医样本，头发，牙齿和骨头

微藻、细菌和酵母的细胞破坏(悬浮)

基础生物学研究、医学研究或应用生物技术的一个标准程序是对酵母、细菌、微藻或丝状真菌进行细胞破坏，以获得细胞蛋白质、代谢物或核酸(DNA、RNA)。不同的细胞破坏技术可以在实验室规模上使用，一般可以分为使用化学物质破坏细胞膜和结构的技术，以及机械方法。

利用机械方法，可以打破芽孢杆菌孢子和分枝杆菌细胞等难以溶解的厚细胞壁。不需要添加可能影响后续萃取步骤的化学物质。

微珠打浆是一种广泛使用、有效且简单的细胞破裂机械方法，涉及陶瓷、钢或玻璃制成的微珠。通过摇动或搅拌将微珠与细胞悬浮液充分混合；由于玻璃珠的大表面积，剪切力会破坏细胞壁，导致细胞成分释放。虽然在2毫升一次性小瓶中，通常使用打珠法进行小规模细胞破碎，但也可用于较大的小瓶，如50毫升一次性Falcon试管。

与其他机械方法(如超声波法)相比，这种方法的优点包括在一个步骤中处理各种样品的可能性，而不存在交叉污染的风险，易于使用，并且细胞成分的收率更高。最直接的打珠技术是将细胞悬浮液与等量的珠子混合，在实验室的涡流搅拌器的帮助下进行搅拌。

然而，这种技术是容易出错和时间密集，特别是细胞分裂时间长达10分钟，或高样品吞吐量。这一过程可以快速、重复和有效地使用RETSCH的密炼机MM 400与各种适配器结合使用。由于细胞是自动破碎的，操作员可以节省时间，用于分析过程中的进一步步骤。

一般情况下，分离DNA或RNA所需的细胞材料少于1ml，因此细胞破坏主要使用1.5 ml或2ml Eppendorf进行^®管。RETSCH为这些小瓶提供了独特的适配器，从而能够在一个步骤中处理多达20个样品。然而，为了提取代谢物或蛋白质，需要更多的细胞悬浮液，因此建议在50 ml一次性试管（Falcon）中进行细胞破坏^®管);MM 400可用于同时处理8个样品(8个样品的30毫升细胞悬液或，如果需要，240毫升细胞悬液分成8个锥形离心管随后的细胞悬液池)。目前，缺失的尺寸在2毫升和50毫升之间的管可与新的5毫升Eppendorf^®管，也可用于400毫米。

案例研究:酿酒酵母的细胞破坏

为了研究，例如细胞蛋白的功能，必须打乱大约30毫升细胞悬液的体积。使用搅拌机MM 400和锥形离心管适配器(同时8个样品)的自动化过程与手动细胞破坏的涡旋器进行了比较。为了获得足够的蛋白质产量，将4克酵母细胞与16克玻璃珠(0.5-0.75 mm)和12克破碎缓冲液在50毫升试管中漩涡，需要12 × 1分钟，中间在冰上冷却1分钟。

同时破坏两个以上的样品只能通过让几个人在一个连续的多个涡旋器上工作来实现。此外，在操作员之间交换样本是必要的，以弥补特定硬件和特定用户的差异。

使用MM 400型密炼机大大简化了实验室工作。该磨机可用于自动中断细胞悬液的各种样品，频率可达30赫兹。可以减少细胞所需的时间中断7分钟,实现更好的蛋白质产量相比,涡流12分钟后(图1)。使用400毫米的自动化过程的另一个好处是最小温度增加时细胞悬液细胞破坏和再现性的改善(图2和图3)。

图1所示。使用旋涡仪和混合器MM 400对细胞进行破坏后的总蛋白浓度。所需的蛋白质产量是在7分钟(MM 400)后达到的，而旋转需要12分钟。

图2。在MM 400 (30 Hz)或Vortexer中细胞分裂时温度升高，细胞分裂每分钟后在冰上冷却。

图3。细胞破碎后总蛋白浓度的重现性增加，在MM 400中7分钟，在Vortex中12分钟;误差柱:%标准差。

通过改变珠粒大小和振荡频率来优化酵母细胞破碎。在提取蛋白质时，有利于将速度降低到20 Hz，从而使总蛋白质含量略有增加，泡沫减少。此外，与30 Hz相比，20 Hz时温度升高较少（图4）。

图4。增加温度，7分钟MM 400在20或30赫兹，没有中间冷却冰上。

当使用0.75-1.00 mm大小的玻璃珠而不是0.5-0.75 mm大小的玻璃珠，并将质量增加到24 g时，细胞破碎的结果有微小的改善(图5)。

图5。mm400细胞破坏的优化。使用0.75到1毫米大小的小球，蛋白质浓度最高(左图);蛋白质浓度受珠数的影响(右图)。

在另一种方法中，使用MM 400进行的酵母细胞破碎过程与超声波破碎过程进行了比较。此外，还比较了50毫升锥形离心管和2毫升一次性使用管中细胞破碎后的蛋白质浓度。5分钟后，通过打珠实现的蛋白质产量接近s比超声波处理的产率高9倍（结果未显示）。25毫升细胞悬液（离心管）和1毫升细胞悬液（2毫升管）之间的差异不显著。

自动细胞分裂过程明显优于其他技术，如超声或手动涡旋已被清楚地证明。该技术允许同时处理多个样品，提供了高的蛋白质产量，保持细胞悬液的温度在可容忍的限度内，并具有良好的重现性。

案例研究:微藻的细胞破坏

微藻(如硅藻)的细胞破坏可能是困难的，因为细胞往往反对玻璃珠产生的剪切作用。在过去，用玻璃珠和摇床一起成功地进行硅藻细胞分裂是不可能的，通常使用的是法压机。当与其他激振器相比混合机MM 400，再加上锥形离心管的适配器，最适合有效地破坏微藻细胞。

将拟南大虾(Thalassiosira pseudonana)的细胞悬液约300 ml离心，在20 ml破碎缓冲液中重新悬浮，并填充到50 ml锥形离心管中;加入40 ml玻璃微珠(90-150 μm和300-400 μm，比例1:1)，在20 Hz下进行细胞破碎20秒。使用显微镜可以观察到细胞的完全破坏(图6)。

图6。使用混合器MM 400结合管适配器对50 mL管进行分裂前(左)和分裂后(右)的地中海硅藻细胞;20秒，20赫兹。

MM 400甚至可以实现对藻类细胞的完全破坏Phaeodactylum tricornutum，它很容易对抗由于缺少硅酸盐细胞壁而产生的剪切效应。将200 ml的细胞培养液离心，重新悬浮于20 ml破碎缓冲液中，转移到50 ml锥形管中。加入40 ml (90-150 μm和300-400 μm，比例1:1)的玻璃微珠，在30 Hz下3 × 60秒内进行细胞破碎。共3min后，显微镜下未见完整细胞(图7)。

图7。使用混炼机MM 400和锥形离心管转接器在细胞分裂前后（左）和细胞分裂后（中、右）三角褐指藻细胞；30 Hz下3 x 60秒。

与使用法式压滤机的技术相比，使用MM 400的打珠过程更省时，因为它可以同时破坏8个样品，并且交叉污染的风险最小化。使用MM 400而不是其他振动筛是值得推荐的，因为它产生的剪切力足够强大，有效地破坏甚至那些细胞，通常反对破坏通过珠跳动。

软硬生物样品(如肝、痰)均质

有时，生物样品的制备和均质过程可能与材料本身一样坚韧。通常使用的2ml单次使用管通常不够大，不能容纳整个样品体积;因此，必须按照均质过程对样品进行分离和团聚，这意味着在实验室常规中执行额外的耗时工作步骤。尽管有更大尺寸的研磨罐——例如不锈钢制成的——可以容纳整个样品体积，但它们的缺点是在使用后必须清洗。

这个问题的理想解决方案是新的5毫升一次性管，不需要清洗。RETSCH开发了一种新的适配器，用于混合器Mill MM 400，容纳5毫升管，从而允许在同一时间制备10 x 5毫升的样品。

生物样本的性质可以有很大的不同，例如囊性纤维化患者的极其坚硬的痰液或肺、肝、肿瘤等组织样本。下面，使用的MM 400结合新的适配器为5毫升的一次性管均质这些样品的描述。

图8。适配器MM 400容纳5个5毫升管。

病例研究:囊性纤维化患者坚硬痰的均质化

囊性纤维化患者咳出的痰经常被匀浆用于常规诊断和研究。使用MM 400混合器可方便地均质痰样;然而，由于过去使用了2ml小瓶，因此处理每个痰样本超过1ml是不可行的。由于痰是一种部分感染性物质，将粘稠、坚硬的痰分成几份进行均质处理是不合适的。另一种选择是使用5ml不锈钢研磨罐，这需要细致的清洗。5毫升反应管的新适配器提供了更高的体积和一次性小瓶的综合优势。

在一项试验中，使用2 - 3个氧化锆研磨球(Ø 5毫米)在30赫兹下均质约2.5分钟，最多3毫升。5毫升试管中处理整个样品的可能性在一个步骤中，减少工作量和节省时间;它还将潜在感染性物质的处理减少到最低限度。

案例研究:肝组织均质化

在生物基础研究、生物医学、分子诊断、毒理学、药理学等许多领域，肝脏、肺或肿瘤等组织样本都是常规研究的对象。用户在这里面临的挑战类似于痰的匀浆。因此，新的5毫升一次性使用管连同混合机MM 400也是一种有效的均质化解决方案，甚至适用于此应用程序。为了使肝脏均质，研究了研磨球的数量、大小和样品体积的某些组合，结果表明，少量10毫米的研磨球比少量更小的研磨球具有更好的缩小组织结构的效果。

使用3个10毫米不锈钢研磨球，可使3克新鲜肝组织充分匀浆，达到最佳效果。将缓冲液填充到反应瓶中，直到最大填充线为止。然后,样本均质5分钟30 Hz和组织残留后无法观察到的过程(图9)。可以实现相同的锥形离心管的均匀化程度与下列参数:15克样品,四个不锈钢球(20 mm), 30 Hz,缓冲区,3分钟。研磨球/样品/缓冲液的重量限制了使用离心管一次只能处理两个样品。在这两种情况下温度的升高都是微不足道的。

图9。肝脏样品均质前后在mm400中。

细胞颗粒、肌肉组织和松针的低温研磨

坚韧、柔软和纤维状的生物样品可以在没有缓冲液的情况下被粉碎。对于像非亚博网站下载常坚硬的静脉或指甲，纤维植物，或不同种类的动物或肿瘤组织的材料，缓冲系统中的均质化不是很有效。然而，低温研磨——即在研磨前或研磨过程中使用干冰或液氮使样品脆化——已被证明是获得均匀研磨样品的理想方法。

与打珠过程相反，在粉碎前冷冻样品的技术也适用于裂解细胞内细胞器，例如酵母。低温研磨的另一个好处是极低的温度，这可以防止蛋白质的降解，或者显著减少研磨时挥发性成分的损失。对于粘稠的样品，如浆果(图11)，低温研磨通常是生产均匀样品的唯一技术。表1概述了通过使用搅拌机MM 400或CryoM亚博网站下载ill低温研磨成功粉碎的样品材料。

表1。用液氮低温粉碎不同生物样品

样本	配件	饲料数量	研磨时间	速度	最后细度(d90) /结果
大肠杆菌	2个研磨罐，不锈钢50毫升 每罐2个25 mm不锈钢磨球	2 x 10 ml冷冻细胞颗粒	2分钟	30赫兹	完整的细胞破坏
肌肉组织	研磨罐不锈钢50毫升 研磨球为25mm不锈钢	10克	4分钟	25赫兹	< 150μm
松针	2个适配器，每个适配器用于10个2毫升反应瓶 每瓶2个5毫米不锈钢球	每瓶2针	3分钟	30赫兹	一次可重复提取20个样品的RNA
浆果	研磨罐不锈钢50毫升 4 x研磨球不锈钢15毫米	2 g	40秒	20赫兹	< 200μm
指甲	适配器CryoMill 4 × 2毫升小瓶 4个5毫米不锈钢研磨球每瓶	每瓶1个指甲	2分钟	25赫兹	< 200μm
大鼠肠道	研磨罐不锈钢35毫升 1 x不锈钢研磨球20毫米	1.8克	2分钟	30赫兹	< 150μm

图10。肉片在低温研磨前后。

图11。低温研磨前后的粘稠浆果。

图12。低温粉碎前后的松针(包括用于RNA分离的琼脂糖凝胶，粉碎后制备的RNA具有良好的重现性和数量)。

适合低温研磨的实验室研磨机

搅拌机MM 400或CryoMill(图13)可有效用于粉碎小样本量。适当的研磨罐MM 400为PTFE或钢;也可以使用1.5或2毫升的一次性小瓶₂)气体，导致研磨罐内压力过高。

用大钳将封闭的研磨罐放入充满液氮的绝缘容器中2-3分钟后夹入MM 400中。由于高能输入和随之而来的摩擦热，必须确保磨削过程不超过3分钟，以防止试样升温并保持其断裂性能。如果需要更长的研磨时间，应对封闭的研磨罐进行中间冷却，以中断这些工作。

图13。50升杜瓦。

RETSCH创建了CryoMill作为MM 400的一个进步，提供了用液氮不断冷却研磨罐的好处，即使在漫长的研磨过程中，也能保持样品和研磨罐的温度在−196°C。如果需要中间冷却，可以对磨削和冷却的周期进行编程。

由于研磨罐在整个过程中始终留在磨机中，并且用户在任何时候都不会接触到液氮，因此低温磨机的操作非常安全。自动预冷功能确保研磨过程不会在达到并保持温度之前开始−196°C。氧化锆研磨罐可与低温磨机一起用于无重金属研磨。

粉碎法医样本:头发，牙齿和骨头

象头发、牙齿和骨头亚博网站下载这样的法医材料通常是易碎的，因此在粉碎之前通常不需要冷却。根据所需的分析细度，样品可能需要在切削磨或颚式破碎机中进行初步破碎，以产生足够小的颗粒尺寸，以便在球磨机中进行进一步处理(<10 mm)。对于预先切割的骨头，可能是新鲜的，因此没有完全干燥(甚至可能有肉残留)，切割磨坊被使用。

RETSCH提供一个完整的系列减少工厂(图14)用于硬、软、有弹性、纤维状和中硬样品材料的初次尺寸缩减。亚博网站下载广泛的附件阵列允许完美的适应一系列的应用。装备……是可能的SM 300带有三个不同的转子和底部筛网，孔径从0.25到20毫米不等。与新鲜和脂肪骨头相比，它甚至可以通过一到两个步骤将干骨头的大小减少到<0.25毫米。为了使最佳适应有关温度敏感性和断裂行为的样品特性，SM 300提供了100-3000分钟的变速^-1它足够强壮，可以磨碎坚硬的骨头。

图14。RETSCH提供不同类型的切削机。

应用实例的骨头

在本例中，使用SM 300，结合六盘转子和孔径为6 mm的底筛，预粉碎700 g骨骼。在3000 min时粉碎骨骼^-1在短短30秒内，产生小于6毫米的碎片(图15)。

图15。在sm300切削机上研磨前后的骨样本。

磨碎牙齿或骨头通常是在球米尔斯使用由氧化锆、钢或碳化钨制成的>5毫米大小的研磨球。大的研磨球有足够的粉碎能力，通过冲击粉碎这些非常硬的样品。在上面的例子中，预先粉碎的骨头使用搅拌机MM 400粉碎;取1克样品装入35ml氧化锆研磨瓶中，用20mm氧化锆研磨球进行精细研磨。

在30 Hz下执行该过程2分钟后，将样品粉碎成尺寸小于200µm的颗粒，从而准备提取核酸。如果样品非常坚硬，可通过液氮脆化来改善断裂行为。yabo214

应用实例的牙齿

另一个例子是牙齿变小。将一颗牙齿放入25毫升氧化锆研磨瓶中，用20毫米大小的研磨球研磨成粉末，材质相同。在mm400中以30 Hz的频率处理3分钟后，样品变成了大多数颗粒小于100 μm的粉末(图16，右)。yabo214

图16。磨前和磨后的牙齿在MM 400搅拌机中。

应用实例的头发

专门为低温研磨而设计的CryoMill和MM 400也可用于研磨纤维样品，如头发。令人惊讶的是，非常健康的头发必须在低温条件下磨碎;相反，不健康的头发可以在室温下磨碎，因为它更容易折断。与非常致密的牙齿或骨骼相比，用较小的磨球磨头发更合适，因为这一过程需要摩擦而不需要冲击。要注意研磨时间，研磨时间要尽可能短，因为样品容易烧坏。例如，在一个25毫升的不锈钢研磨罐中加入1克头发，其中包括6个直径10毫米的不锈钢球。在25 Hz下磨2分钟后，样品被磨成小于160µm(图17，右)，适用于药物控制等分析。

图17。人发前后在MM 400中细磨。

RETSCH的研磨机非常适合粉碎不同类型的法医样品，用于分析或提取核酸。此外，通过预切割和精细研磨，可以分两步轻松制备更大的样品，如完整的骨骼。

从人体组织中获得完整细菌细胞的洗涤程序

人工关节置换(如膝关节或肘关节)后可能发生感染:与关节置换相关的主要风险之一是由不同种类的细菌引起的所谓假体关节感染(PJI)。例如，在假体关节感染的情况下，必须在不破坏组织样本的情况下清洗掉组织样本上的细菌，然后再培养它们，以达到诊断目的。

在手术室、预防性抗生素、手术技术和仔细选择患者等方面进行了一些改进之后，目前报告的PJI率在2%的范围内，表明每年仍有相当数量的感染。PJI可能发生在手术后三天内;然而，它也可能需要数年时间才能爆发。由于PJI是由相当不同的微生物引起的，定性治疗的分类比较复杂。

不幸的是，基于所采用的技术，记录率是有限的——在某些情况下，不可能使用传统方法记录感染。密炼机MM 400在这里有一个作用。步骤很简单:用20毫升无菌除盐水稀释样品，将样品放在一个高压罐中，罐中有5毫升直径1毫米的玻璃珠。也可以使用在30赫兹下搅拌3.5分钟的一次性罐子。在这个过程中，微生物从样品中被洗掉而不被破坏，使它们可以很容易地在琼脂平板上复制。使用这种方法可以获得良好的文档率(a.l。Roux et al 2010)¹．基本上，它可以用于任何固体感染组织样本，不管植入材料的存在。

搅拌机轧机MM 400:一个真正的多用途实验室轧机

以上讨论的所有应用实例表明，由于广泛的配件选择，RETSCH的密炼机MM 400是高度通用的。它最适合一次性使用瓶中的细胞破坏，例如，50毫升锥形离心管或更小的反应瓶(0.2/1.5/2/5毫升)。MM 400是理想的研磨或破坏范围广泛的硬，脆和软，纤维，半硬，或弹性材料，如骨头，植物，细胞组织，松针，制药产品，矿物，羽毛，木材，或化学品。亚博网站下载工作频率最高为30赫兹，研磨尺寸可降至5 μm。

图18。混合器磨MM 400与适配器8 × 50毫升锥形离心机管(以下)和各种配件，例如，适配器一次性反应瓶(左)，研磨罐，和研磨球(右)。

结论

从通过均质和粉碎进行细胞破碎的珠打浆到低温研磨，RETSCH为诊断、生物技术、微生物学、农业和法医学等领域的样品制备提供了可靠和方便的解决方案。

参考资料及进一步阅读

1. A.-L.Roux，V.Sivadon Tardy，T.Bauer，A.Lortat Jacob，J.-L.Herrmann，J.-L.Gaillard和M.Rottman：通过假体周围标本的beadmill处理诊断假体关节感染；临床微生物学和感染，2010年，欧洲临床微生物学和传染病学会，CMI，17445–450。

本信息来源、审查和改编自RETSCH GmbH提供的材料。亚博网站下载

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