用在线粘度计测量聚合物，蛋白质

概括

在线粘度符测量与GPC耦合的聚合物、蛋白质和多肽的内部粘度，以表征基本的物理化学性质，如摩尔质量、大小、构象和分支比率的分布。

代表下一代粘度计，Viscostar III利用多种技术创新，提供更高标准的敏感性和稳定性。本文介绍了这种创新和由于其实施而记录的福利。

介绍

在表征聚合物时，在线粘度率长期以来一直与凝胶渗透色谱（GPC）或尺寸排阻色谱（SEC）一起使用。如图1所示，敏感差分粘度计使用毛细管桥来测量含有聚合物样品的溶液的小增量粘度，所述溶液相对于单独的溶剂的粘度含有聚合物样品。

该值表示为无单位的“特定粘度”η_SP.．其值除以浓度，由诸如Optilab T-Rex差分折射率（RI）检测器的在线浓度检测器确定，以计算本征聚合物粘度η。

特性黏度(IV)被认为是聚合物固有的有价值的特性，当与其他实验数据相结合时，如DAWN HELEOS II MALS探测器获得的多角度光散射(MALS)数据，它变得更加突出。

与浓度一起分析，MALS提供了分子量和大小的第一性原理分析，不需要参考标准品或柱保留体积。用MALS可以得出摩尔质量范围在200 Da到1 GDa之间。同时，可确定的均方根半径的大小范围在10 ~ 500 nm之间。

图2说明了基于列校准的单个检测器GPC可以产生不可靠的分子量结果，而MALS结果是坚固且准确的。

图1。用于差动粘度计的毛细管桥。IP和DP是整体和差压传感器。通过调节电阻比R1 / R3 = R2 / R4，桥梁平衡（使DP = 0通过所有四个电阻毛细管R1-R4）。当样品流过R1，R2和R4时，在延迟柱通过溶剂至R3时进行样品测量。具体粘度计算为η._SP.= 2 dp / (IP-4DP)。

由于同时MALS-IV计算产生多个样品性质，因此MALS和IV的共分析变得更相关，包括：

• Mark-Houwink-Sakurada参数
• 从1nm和Up和Up的流体动力学和均方根半径
• 构象（随机线圈，分枝，球状）
• 分支比，每分子分支和排水系数

特别是如果它们是强荧光的，一些聚合物对MALS分析没有反应。因为它们与溶剂(dn/dc=0)或溶液是不透明的，这样的聚合物散射弱。对于这些应用，在线粘度测量可以不使用MALS，通过以下渠道来表征分子量:

• 普遍校准-采用理想的(立体)样品-柱相互作用的技术。
• Mark-Houwink-Sakurada分析- 利用针对每个样品或溶剂组合单独确定的经验参数的技术。

无论使用的技术是否是SECMALS-IV或SEC-IV，内在粘度的清洁测量需要超过基本技术。

图2。比较单检测器GPC(蓝色)和MALS分析(红色)的分子量为29 kDa聚苯乙烯标准。虽然MALS的分子量范围很窄，在29-30 kDa左右，但色谱柱标定表明，在20-40 kDa范围内，该峰是多分散的。

克服在线粘度赛的挑战

η的大小_SP.对于从GPC色谱柱洗脱的低浓度聚合物，可能只有百万分之几(ppm)，使差示粘度计高度敏感。

尽管如此，它必须同时对HPLC泵脉冲或室温变化产生的压力和温度波动，并且可以产生与样品相当的各种压力信号。差动粘度率的技术进步主要旨在提高克服环境噪声信号的样本灵敏度。

泵脉冲免疫

HPLC泵运营商了解定期压力脉冲在操作中很重要。这些脉冲通常是对折射率（RI）HPLC浓度探测器定量的最终限制因素，尽管预期精心设计的装置克服这种脉冲以及抑制低于PPM水平的光学响应。

然而，差分粘度计应该测量压力变化。因此，与其他类型的检测器相比，克服这种脉冲不太直接。通常，存在两层技术，用于解决脉冲的IV测量，桥梁平衡和电子平滑。

桥梁平衡

一般来说，新仪器的状态，理想平衡的毛细管桥，所有四个臂都具有相等的流动阻力和体积，原则上应该完全消除流量的波动。

然而，在实践中，源自桥对称性的脉冲取消效应将是显着的但不完整的并且可以随溶剂粘度和流速而变化。由于衰老和毛细血管壁上的污染物的积累，桥梁也倾向于在一定时间内延续平衡。

它是如何完成的

为了克服平衡损失，工程师已经探索了通过滑动密封探索使用自动机械调节毛细管R3长度。当R1 / R3 = R2 / R4时，桥梁重新平衡。不幸的是，滑动密封件代表可靠性链中的潜在弱链路，因为它们在侵蚀性有机溶剂下易于降解和泄漏。

在Viscostar III中

如美国专利7,213,439中所述，桥梁的热调谐利用通过调节调谐毛细管的温度来平衡毛细管桥的非机械方法，从而调节其电阻。

如图3所示，调谐元件与R3相邻。在调谐期间，期望的流动相通过GPC测量期间以相同的流速运行整个仪器。在调谐过程（图4）中，自动调整调谐毛细管的温度，以使DP信号归零，到0.001psi内。

该图显示了约0.03的调节°C必须保持在0.0001 psi（0.7 pa）内的桥梁余额。考虑到仪器的整个热围栏被调节到0.005以内，这一要求易于实现。°C.在10分钟内完成的整个过程，使其完全可以每天重新平衡桥梁。这种活动不可取。

更好的反应是重新平衡溶剂或流速（如果保持相同的溶剂和流速，则每周一次）以确保最佳性能。由于热调谐能够迅速响应泄漏，因此可以建立Viscostar III作为下一代设备。

图3。在Viscostar III中的毛细管桥，实现R3的热调谐和用于完全阻抗匹配的脉冲补偿元件。

图4。热桥调调谐只需十分钟即可，不需要过度困难的温度调节。黑图显示了调谐毛细管的DP信号与温度的变化。

脉冲补偿

实际上，没有理想的毛细管桥。桥梁第三臂中的延迟栏自然地产生体积不平衡，即使四个臂完全平衡抵抗。如果流量和压力是恒定的，则该体积不平衡并不存在问题。

然而，通过不等体积的压力脉冲的发展意味着它在其他毛细血管之后到达R3，最终表现出动态不平衡。因此，泵浦脉冲出现在IP信号中，特别是在超灵敏DP信号中。

它是如何完成的

虽然脉冲出现在IP信号中，但它们对整体特定粘度的影响很小。实际上，DP信号比这些脉冲更复杂且致力于。在过去几十年中使用的DP换能器是膜传感器。

这种换能器中的传感膜具有几秒钟的弛豫时间，便于将粉碎和隐藏泵脉冲作为副作用的过程。同时，膜的长时间恒定也扩展了色谱峰的后缘并有助于分辨率损失。因此，先前的差分粘度计通常具有平庸的色谱分辨率。

在Viscostar III中

与粗脉冲涂抹相比，Viscostar III带来了针对真正的脉冲补偿和过滤的多层方法，与峰值宽度相关的粗脉冲涂抹。

阻抗匹配

完全阻抗匹配是在硬件或流体水平引入的脉冲补偿中的第一个进步之一。为了通过延迟塔补偿脉冲传播不平衡，在桥的相对侧添加第二延迟体积。通过适当的匹配体积，在桥的左侧和右侧传播的脉冲同时到达DP换能器，然后抵消。

虽然对称性并不完美，如图5所示，阻抗匹配将DP脉冲减少约100次，而不会丢失其色谱分辨率。与换能器相邻的补偿量的位置意味着它不会影响静态桥梁平衡，样品不会通过它，并且不会严重影响任何特定的粘度测量。

脉冲过滤

脉冲补偿中的第二个进步是软件中残留DP脉冲的匹配过滤。因为这些脉冲以固定间隔到达，所以很容易确定其频率或通过使用傅立叶滤波来移除它们。图5显示该算法消除了完全剩余的脉冲。

专有计算

在从DP信号中消除脉冲之后，IP中的小波动仍然影响特定的粘度计算。第三前进通过专有算法（美国专利7,331,218）消除了这些波动的贡献，该算法（美国专利7,331,218）利用基线IP值并计算SP而不参考瞬时IP信号。

集成在Viscostar III中的多层脉冲补偿技术可实现色谱质量和样本的更好的灵敏度，而不是系统性质。

图5。先进的脉冲补偿在DP传感器信号。第一层，通过补偿体积进行阻抗匹配，将脉冲振幅降低了约100倍。第二层，在软件中对泵浦频率进行滤波，消除残余脉冲。

热稳定性

热稳定性的基本元件是良好的被动隔离和用于调节和温度稳定性的有源热元件。在差动粘度计中，即使室温变化几度摄氏度，桥毛细管应保持在恒定温度约为0.01°C的恒定温度。因此，即使被动隔离处于高电平时，也需要主动热管理。

被动隔离

在设计精心设计的粘度计中，毛细管通过巨大的热沉降彼此保持良好的热接触，但远离室温变化或仪器内的变化。前者通过将毛细管附着到单个金属块中而满足，而后者涉及在所有流体和换能器部件周围构建绝缘绝缘盒。

从热盒或良好的热接地中取下任何组件，尤其是桥或延迟柱，打开系统到热漂移和相应的换能器信号的基线漂移。Viscostar III在全面设计，并在检查中保持最佳的被动隔离，实现最佳的工程实践。

活跃的监管

通常，被动隔离不足以高灵敏度。因此，需要具有反馈的活动元素。

它是如何完成的

几种仪器使用简单的加热元件，但这通常会限制热稳定范围到10°C以上温度和更高。单独加热，仪器不能在室温下稳定。

更先进和创新的设备，如ViscoStar二世，利用热电peltier为基础的热调节。这个装置能使仪器加热或冷却。Peltier调控提供了在室温下的稳定性，并降低了蛋白质、多肽或其他敏感样品可能需要的温度。

主动热调节的另一个方面是主动元件和温度传感器的数量，以及它们在热盒周围的位置。这种设计通常只包括一个有源元件和一个或两个传感器。物理学表明，从单个有源元件辐射出来的热梯度最终将在仪器中形成。这种梯度会造成某种程度的漂移。

在更大程度上，梯度可以通过严格的工程过程来控制，但如果没有额外的主动元素，就不可能完全克服它。

在Viscostar III中

粘星III型采用了热工作台的双peltier分布式调节。如图6所示，这种设计允许在较宽的温度范围(4 - 70)进行主动控制°C)并消除热梯度是自然的单一元素设计。这导致更快的热平衡，更好地隔离室温波动，并减少热漂移。

图6。Viscostar III稳压的热调节利用两个Peltier单元消除热梯度和伴随信号漂移。

传感器可靠性

前一代粘度计中使用的DP换能器非常敏感和脆弱。超压和腐蚀被记录为这些仪器失败的主要来源。

过度压力

通过高流速，高溶剂粘度和堵塞管的任何组合可能引起过高的压力。已经进行了不同的方法以保护DP换能器免受可能破坏膜的压力水平。

它是如何完成的

在维斯克星II中实施的被动保护采用标准的HPLC反压调节器，以确保任何超过限制的系统压力都可以安全地转移到废料管道。虽然这种方法在某种程度上是可靠的，但它不能有效地通知用户任何超压。如果样品被浪费了，那么很可能是测量损坏了，但是不会向用户传递关于这样一个事件的消息。

额外的保护可以通过两种方式来完成:通过监测DP信号或通过打开传感器清洗阀来释放多余的压力，如果信号超过允允值。这些机制只是部分解决方案，因为它们不响应不产生压差信号的高系统压力。当DP传感器被保护时，其他敏感元件就不需要处理了。

在Viscostar III中

具有有源传感器和系统保护意味着仪器的所有组件都被监控和保护免受过压。在Viscostar III中，内部传感器和有源释放阀更换了无源保护装置。当系统背压超过安全限制时，释放阀被电子激活以转移溶剂流，绕过桥梁，DP和IP换能器。

Viscostar III的系统压力传感器提供了可在各种时间段内访问的连续压力读数，以确定堵塞的积累或系统维护的任何需求。如果由于过压而被激活，则在通知之后用户可以促进诸如中止测量的补救措施。

vististar III设计依赖于内部软件，包括一个“常开”阀门，当仪器关闭时，该阀门可引导溶剂流动绕过桥架。因此，即使在不使用设备的情况下，组件仍然是完全保护的。

腐蚀

差动粘度计中使用的高灵敏度磁性压差换能器由410个不锈钢制成，焊接的Inconel帽制成。410不锈钢材料，特别是IT和Inconel之间的焊接接头，易于通过含盐的水溶液腐蚀。因此，有限地利用蛋白质应用或需要中等至高盐或极端pH水平的类似设置中的在线粘度计。

它是如何完成的

降低腐蚀敏感性的一个主要方法是用一种没有焊接接头的单一材料制作整个传感器;然而，磁性材料通常容易受到高盐缓冲液亚博网站下载的腐蚀。

另一种解决方案是用耐腐蚀材料(如PTFE3)在换能器的湿润部分进行布线。如果涂层不会降解，这种方法就会很有效。虽然这两种方法都提供了防腐保护，但解决腐蚀的更好方法是可用的。

在Viscostar III中

有效的传感器将没有腐蚀的湿润材料或关节，易腐蚀。亚博网站下载ViscoStar III用压电换能器取代磁膜换能器，该压电换能器不需要磁性金属膜。在新的DP换能器中，所有湿润的表面都是316不锈钢（在大多数HPLC系统中发现的材料，即使在高盐浓度下也具有优异的耐腐蚀性）和PTFE。

开发了ViscoStar III中的整个流体路径，以消除易受腐蚀或损坏的苛刻有机溶剂的所有材料。亚博网站下载该仪器呈现出各种水性和有机溶剂内的优异溶剂相容性。

更多的好处

与其他上一代设备相比，新型DP传感器在腐蚀方面具有更大的优越性。除此之外，该器件还具有比磁膜换能器快得多的响应时间，这意味着前面提到的泵浦脉冲补偿的好处可以通过减少峰展宽来实现。

图7显示了压电电阻DP换能器的优势。例如，作为BSA单体和二聚体的秒的副产物的DP峰在Viscostar III中显着较大，而不是在上一代仪器中。由于先进的脉冲抑制技术，更快的DP传感器响应不会导致来自泵脉冲的信号波动。

图7。BSA单体和二聚体的色谱图，如前一代粘度计（红色）和Viscostar III（蓝色）的DP信号中所示。Viscostar III大大减少了先前世代的缓慢DP传感器诱导的人工频带扩展，允许在670秒处分离BSA二聚体。

下一代粘度计

在以前几代的差分粘度计中，工程师已经找到了解决一些关键挑战的方法。常规仪器尽管有可疑的可靠性，但会轻易地执行;然而，利用Viscostar III，实现了更高的寻址和消除技术痛点。该实现产生具有增强灵敏度，稳定性和溶剂兼容性的下一代仪器。

动态范围、灵敏度和分辨率

动态范围定义为可以测量的最大和最小信号的比率。它表示可以分析的所有样品和条件。Viscostar II的动态范围超过35,000：1，超过竞争仪器至少四次。Viscostar III将其前身的范围扩展到超过135,000：1，迄今为止，这是市场上最好的仪器。图8显示了大型动态范围的一部分。

在图9中，提出的是各种浓度的环氧树脂的灵敏度和分辨率的改进。前一种（Viscostar II）和下一代（Viscostar III）装置的固有粘度测量值具有良好的质量，其中样品浓度相对较高，横跨主峰。

然而，在浓度低的情况下，例如在18至24分钟的前沿，Viscostar III测量提供了更强大的分析。事实上，Viscostar III的敏感性在仅0.05Pa，意味着它可以通过良好的保真度来注射仅0.1μg的100kDa聚苯乙烯。这比Viscostar II好三倍，比竞争粘度计好十倍。

图8。特性粘度测量的聚乳酸-乙醇酸(PLGA)和羧甲基纤维素，涵盖范围大。个位数的特性粘度也很容易测量。

溶剂的兼容性

分析仪器在各种条件和抗腐蚀的鲁棒性中需要多功能性。已显示Viscostar III抵抗困难的溶剂，例如：

• 四氢呋喃与10%甲酸
• 100毫米醋酸盐缓冲液，pH 3.5
• DMF，具有0.1％LIBL
• 1％乙酸+ 500毫米NaCl
• 800ppm SDS + 250ppm NaN_3.
• 100毫米Na₂SO4 + 250ppm NaN_3.

稳定

图9所示的优良特性粘度结果表明了该产品的稳定性ViscoStar三世贯穿整个过程。其他测试表明，与最终可能由空调循环造成的室温波动有良好的隔离。事实上，visstar III的基准漂移比其他同类仪器高出50倍，保证了在大范围下入或多次注入过程中高效稳定的性能。

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图9。环氧树脂的固有粘度。TOP：100μL注射，Viscostar II（蓝色）与Viscostar III（洋红色）;底部：12.5μL注射，Viscostar II（绿色）与Viscostar III（棕色）。虽然内在粘度结果对于前一代粘度计（Viscostar II）和下一代（ViscoStar III）的主要峰值上具有良好的质量，其中样品浓度低于较高的信噪比和测量质量新仪器很明显。

结论

代表下一代在线粘度计，Viscostar III在性能和多功能性方面具有重大飞跃。再加上ASTRA和行业领先的曙光Heleos II MALS检测器和Optilab T-Rex折射率检测器，Viscostar III是最复杂的GPC聚合物，肽，蛋白质和更多的选择的粘度计。

此信息已采购，从Wyatt技术提供的材料进行审核和调整。亚博网站下载

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