荧光光谱经常发生明显的畸变。这在很大程度上是可以预测的，是由浓度依赖的内滤效应(IFE)引起的。因此，用户有责任评估与样品浓度相关的吸光度值。这就给出了Beer-Lambert线性要求。
当激发光被样品中的组分吸收时，可以看到初级内滤光效应(PIF)。这发生在它到达激发和发射光束路径相交的区域之前，在这一点上荧光可以被激发并因此被检测到。
次级内滤光效应(SIF)发生在上述激励和发射光束路径相交区域发射的荧光，然后在它能够离开电池到达发射探测器之前被样品成分吸收。
PIF和SIF都可以由吸收光的样品组分引起，无论这些组分是否发出荧光都可以发生。
这种效应在任何OD值下都持续存在于重叠的吸光度和荧光区域。
有很多关于IFE修正的研究所有这些都涉及到公式，然后测试方程处理细胞路径长度，细胞位置，光学系数和光束几何;后者由激发和发射光束路径的焦点特性(f数)定义。
通常的做法是在感兴趣的荧光激发和/或发射光谱区域重叠的点上测量样品的吸收光谱。在理想的情况下，这将与同一细胞内的荧光测量同时进行，使用相同的仪器来帮助最小化由于样品的状态或几何形状而造成的差异。
本文提出了一种同时产生单个激发和发射光谱的新方法，该方法可用于所有荧光样品组分，同时提供了吸收光但不发出荧光的组分的有用信息。它还能够提供所需的信息，以纠正荧光光谱，样品浓度依赖的IFE可能是一个问题。
仪表
在这项研究中A-TEEM™方法探讨了。该方法使用Aqualog专利技术，同时提供吸光度-透射和荧光激发发射矩阵光谱®来自堀叶仪器公司
Aqualog®是一种光学平台，具有特殊的像差校正，双光栅激励单色仪。它还包括一个吸光度检测器，一个参考检测器(都是硅光电二极管)和一个由摄谱仪和一个热电冷却，背光源CCD组成的专门发射检测器。
该系统可以增量扫描激发在各种能量级别，范围从高到低的能量需要。然后，它可以收集和整理完整的发射光谱在每个激励增量，以便快速和同时生成吸收光谱以及完全校正的激发-发射矩阵或光谱图。
的Aqualog®包括捆绑的软件，功能为标准化到水拉曼散射的内置工具，或使用奎宁硫酸盐为定义的发射条件。此外，修正瑞利掩蔽或IFE的影响也包括在内。
这Aqualog®Datastream包允许对完全校正的EEM数据进行分析，它基于多变量例程，通常称为PARAFAC。
当前的应用程序
水的质量
在饮用水处理厂主要使用地表水的地方，有必要进行监管。这是因为水中的某些成分可能是有毒消毒副产物(DBPs)的前体，这些副产物在分配系统中随着时间的推移会与卤化消毒剂发生反应。
总溶解有机碳(TOC)是一种常见的成分，在不可预测的模式下可能会有相当大的变化。这些模式与一些事件有关，这些事件会影响有机物向水源的零星排放，例如融雪或降雨。亚博网站下载
可以看到，Aqualog®在一个处理地表水饮用水的高度典型的水处理厂中，已被用于监测与EPA第2阶段消毒副产品规则(DBPR2)符合性有关的溶解有机物。
原水和成品水的相同样品在分析前被过滤到0.45 μm。此外，在进行分析之前，这些样品与25°C的室温相匹配。
在这个例子中，Aqualog®EEM和吸光度测量条件包括激发/吸光度范围在250到600 nm之间，使用3 nm作为激发间隔，3.28 nm作为发射间隔。它还使用了一个中等增益和2秒积分的发射检测。
用于发射和吸收的空白样品是Starna Scientific Inc.的密封无toc水样Starna 3Q-10。所有的3.5 ml样品使用1 cm径长的超prasil 4-way透明荧光石英试管进行分析。
该示例比较了在同一日样本集中测量的原始和成品水样的普通EEM和吸光度曲线。
原水的EEM数据显示，原水的峰值强度约为成品水的6.25倍，初级发射带更宽，且有相当大的红移。
与成品水相比，原水的吸光度在每个波长上也表现出更高的消光。
为了正确评价与处理相关的EEMS的定量变化，PARAFAC分析已应用于每个样品，以分解核心荧光组分的激发光谱、浓度负荷和发射光谱。
在这个示例中确定了三个关键组成部分:-
- 组分1 (C1)被鉴定为相对较低分子量和芳香性的腐殖质/黄腐质组分。
- 成分2 (C2)为腐殖质/黄腐质组分，具有较高的分子量和芳香性。
- 成分3 (C3)被鉴定为蛋白质样成分。
上面的图像对比了三个组件的归一化PARAFAC浓度负荷。这是对每天的生水和成品水样所做的。可以看出，组分2在原水中始终较为突出;而在成品水中，成分1最为显著。
组分3的相对浓度在处理间基本一致，而组分2的提高去除率符合混凝剂的预期效果，对高分子量有机物的去除效果优于低分子量有机物。
可以看出，该模式与原水中EEM波段较宽的红移光谱有明显的相关性，这与之前的图像中显示的成品水相比。
葡萄酒分析
普通的红酒含有一些有颜色和荧光的成分。这些物质主要是多酚类物质，对味道和颜色等质量参数的测定至关重要。
荧光光谱和紫外可见光谱为检测和解析这些成分提供了可能，这意味着这些成分可以被有效地表征，揭示红葡萄酒的独特成分性质。
可以结合吸光度、透射和荧光EEM数据来评价批次间、区域和品种特征。这种组合也可以用来感知老化、氧化和亚硫酸盐处理的影响。
上面的图像显示了同时记录的EEMs (A)和(B)，吸光度和透射光谱百分比(C)和(D)，来自新鲜打开的一瓶典型的意大利红酒。它也强调(A)和(C)和暴露在空气中一周后(B和D)。
Aqualog®EEM和吸光度测量条件包括激发/吸光度范围，从200到800 nm，增加3 nm。它们还包括250到800 nm的发射范围，在中等增益时增加4.65 CCD bin和0.1秒的集成时间。
这些复杂的EEMs突出了紫外激发-发射范围的主要轮廓，主要激发/发射峰出现在275/309 nm左右。
在此之前和之后的样品显示，吸光度和透射光谱都在约275 nm处有一个主要的消光峰，在320 nm处有一个较小的肩峰，在520 nm处有一个次要的峰。
这个275 nm的峰至少部分与酚类化合物有关，而520 nm的峰区域通常与花青素类化合物有关。与前(C)和后(D)样品相比，这些样品在整个吸收光谱中显示了更大的消光。这通常与氧化现象有关。
EEM的谱线非常复杂，它们由多个重叠的激发和发射成分组成。它们的复杂性严重限制了对主要轮廓元素的定量和定性视觉解释。
正因为如此，我们经常使用多元分析来在质与量的上下文中分解EEM成分。
本研究评估了PARAFAC模型，在这种情况下，该模型对所有得分和加载参数都进行了非负值的限制。下表突出显示了在PARAFAC模型中解析的五个光谱加载成分，该模型使用了所有复制的新鲜和氧化的葡萄酒样品。为了进行额外的初步鉴定，我们将这些成分与现有文献进行了比较。
下图显示了葡萄酒样品中每一种PARAFAC成分的氧化效果的对比。其中，组分1是氧化前后最显著的组分，较深的紫外发射组分(1、2和3)比较长的发射波长组分(4和5)增加得更多。
胰岛素的结构与分析
作为一种蛋白质激素，胰岛素由胰腺产生，在基本的代谢过程中必不可少。商业胰岛素疗法通常分为两大类，即速效和长效胰岛素。
短期和长期作用胰岛素都非常相似，它们之间的差异在蛋白质序列的1和3个残基之间很小。这些微小的序列变化以及存储和输送过程中pH值的控制被用来触发或阻止胰岛素二聚体和六聚体在血液中的形成。
当这些聚集物形成时，它们允许身体更慢地吸收胰岛素。相反，这些聚集物的缺乏会导致身体更快地吸收胰岛素。蛋白质稳定性和结构的变化，如胰岛素药代动力学的核心，通常使用荧光发射光谱、紫外-可见吸收光谱或偶尔使用天然荧光氨基酸两者测量。
商业胰岛素的形成是高度浓缩的(4毫克毫升−1)，这意味着IFE校正对于A-TEEM的精确测量至关重要™指纹。如下图所示。
在这里，三种不同浓度的胰岛素蛋白被分析。它们的pH值为4.5至8.5，温度为5°C至37°C。胰岛素类型如下:
- 重组人胰岛素[10]
- 胰岛素-天冬氨酸(市售，速效)
- 甘精胰岛素(市售长效)
使用PARAFAC分析测量本征荧光A-TEEMs™可以对每种胰岛素的聚集状态进行表征。在商业地层中确定了四个组成部分:-
- 成分1、2和3 (Comp1、Comp2和Comp3)鉴定为酪氨酸[11]
- 成分4 (Comp4)鉴定为间甲酚[12]-胰岛素制剂中的一种防腐剂
上图中的红色数据点说明了四组分PARAFAC模型在pH为4.5(前5个数据点)、pH为7.4(后5个数据点)和pH为8.5(后5个数据点)条件下的分数，该模型适合重组人胰岛素溶液。
5个重复的温度依次为5°C、20°C、25°C、30°C和37°C。重复模型并绘制甘精胰岛素(绿色数据)和门冬胰岛素(蓝色数据)在相同的顺序条件下。
如例子所示，甘精胰岛素(通常在生物的pH值和温度下进行排序以产生聚集物)在成分1中得分要高得多(星星)。这可能是由于当胰岛素处于聚集状态时，酪氨酸的蓝移谱。
相比之下，人类胰岛素和门冬胰岛素溶液(在相同条件下不太可能聚集)在相同成分上的得分要低得多。
鉴于上述结果，很明显，胰岛素序列仅由1到3个氨基酸变化，可以使用固有荧光A-TEEMs进行区分™．
因为商业胰岛素的形成有高浓度和吸光度值，A-TEEM™方法是表征这类商业蛋白治疗制剂的理想溶液，特别是在传统荧光方法可能无法达到预期结果的情况下。
值得注意的是，这项研究并没有提供关于胰岛素的新信息，也没有提供这些特定蛋白如何根据配方条件聚合或不聚合的新信息。然而，它确实提供了对A-TEEM如何™方法可用于表征蛋白质治疗形成的聚集行为，即使在条件下，只有微小的差异，蛋白质序列。
EEM已经证明了它在生物学领域是一种高度相关的方法。此外,A-TEEM™指纹技术理论上可以用于其他蛋白质治疗，如疫苗、抑制剂、酶和抗体。
结论
荧光已经被高度认为是一种非常灵敏的工具，用于表征多种样品类型。然而，当与其他测量技术结合时，荧光的电位会变得更大。
的A-TEEM™方法这是在Aqualog专利中实现的®是同类仪器中唯一能够对荧光光谱进行实时、同步的内部滤波校正，以提供真实的、nist可追踪的分子指纹。
在需要绝对的和可复制的分子指纹库时，这种准确性和质量水平是至关重要的，必须依靠这些库对广泛和多样的基本物质进行可靠的定量分析。
正如这篇文章所探讨的，A-TEEM™方法-与Aqualog联合使用®荧光分光计-已被用于监测原水处理，为其用户提供一个快速，准确和易于使用的工具。
这种应用已经扩展到其他领域，如葡萄酒研究，在那里技术提供了机会，以确定葡萄酒的主要化合物和氧化水平。
这种多模式方法在许多领域都有巨大的应用空间。在食品工业、生物医学和石化工业中具有实际应用的潜力。此外,A-TEEM™已经被证明是一种非常有效的方法来区分不同类型的现有胰岛素。
这些信息来源于HORIBA Scientific提供的资料。亚博网站下载
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