荧光光谱 - 应用和原理

荧光光谱基于关键原理和应用的数量。这些在下面概述。

什么是Jablonski图？

Jablonski图于1933年开发。它是荧光现象期间分子电子状态过渡的良好尊敬的示意图。在下图中，左轴突出显示了正常荧光分子具有吸光度谱的增加能量。这种吸光度谱说明了分子吸收光的波长或能量。

图1。分子吸光度和荧光的Jablonski图

如果入射光处于分子能够吸收光子的波长，则分子本身从电子接地态到更高的激发态激发。这显示为S₂在图中。

在此过程中，电子会经过内部转换，因为它们受到环境的热量损失和振动松弛的影响。接下来，从最低的躺椅激发状态发出光子。这是荧光。

在更常见的荧光发生过程中，光子在波长更高的波长下发射，比被吸收的光子发射。

该图对于理解荧光至关重要。从检查图本身可以理解，荧光光谱的测量涉及检查分子发出的强度，发射的能量以及分子在其激发态下花费的时间。这些测量的后者被称为荧光寿命。

这些可观察的物品可能会受到各种因素的影响，例如其他分子淬灭，来自其他分子，pH，局部极性，温度，结合或聚集的能量转移。能够理解这些相互作用中每一种的潜在机制可以提供真正的洞察力，可以准确地了解查看荧光光谱或寿命变化时所看到的内容。

存在两个非放射性停用过程，与荧光直接竞争。这些是从激动的单线到三重态的间交叉，以及从最低单线到基态的内部转换。

这两个过程中的前者导致一种特定现象称为磷光。

什么是荧光寿命？

在最基本的情况下，分子的荧光寿命可以理解为其在激发状态下花费的平均时间。

图2。荧光荧光素（红色），仪器反应（蓝色）和拟合（绿色）的荧光寿命衰减。错误残差显示在下图中。在这里，寿命约为4.0 ns。

这在很大程度上取决于所讨论的分子及其本地环境的类型。分子的激发状态以指数式的方式衰减，如下方程所强调。

测量荧光寿命而不是标准强度测量提供了特定的优势，特别是它是绝对测量值，而不是相对稳态测量，只能提供时间平均信号。

i（t）= i₀经验^（-t/τ）

在这里，τ是荧光寿命或强度衰减至其初始值1/e的时间。

如果该分子具有多个激发态的存在，则可能是因为被检查的样品实际上包含一系列荧光分子。如果有不同的本地环境或分子发生转化，则可能会导致具有不同的激发状态，从而使衰减更加复杂。

但是，每个激发状态都只能有一个指数衰减，这可以由下面显示的指数总和表示。在此示例中，α（指数前因子）表示每个T衰减与观察到的总体衰减的相对浓度。

为了有效地比较测量值，以某种方式将指数前因素归一化是有益的。

每个比较荧光物种需要，然后可以使用归一化的α。如果需要比较对稳态光谱的贡献（总荧光发射），则可以使用分数或相对幅度（以％）。这两个值的后者是由寿命加权的指数率因子。

图3。获得荧光寿命，组件时间常数，幅度和平均值的方程式

有时，通过显示平均寿命来表示复杂的衰减同样可以接受，但是应注意，最好通过正确对复杂衰减本身进行正确建模而不是试图将单个指数衰减附加到其上来完成。

但是，在许多情况下，使用幅度平均寿命是最佳选择。但是，在考虑淬火实验时，最好使用强度平均荧光寿命。Lacowicz（2006）和Berezin（2010）发表的作品探讨了这些平均值的优点。

什么是磷光？

如前所述，磷光是从禁止的三重态发射光子的过程，而不是单线激发态。A荧光发射通常位于皮秒至纳秒范围内，但是磷光通常持续到微秒，毫秒甚至更长的时间，有时甚至更长，有时只有几分钟或小时。

图4。Jablonski磷光发射图

对于磷光，使用脉冲源（例如LED或闪光灯）来测量光谱并在这些较长的时间尺度上衰减。这些测量值可以使用较长的脉冲源，例如氙气闪光灯，闪光灯的时机通常用于测量在各种磷光寿命下存在的光谱。

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