增加图像的信噪比和分辨率的方法

反褶积是一种计算技术提高分辨率和信噪比(信噪比)的图像捕获的成像系统。使用之前共焦显微术的广泛使用,但由于计算能力的缺乏,这不是普遍应用。

今天的计算能力,特别是大规模并行图形处理单元(gpu),坏了几乎所有的进入壁垒,这台式电脑配备合适的显卡可以实现近实时反褶积。本文引入了反褶积的概念作为一种日常的成像工具,应该经常应用于所有图像捕捉到一个显微镜系统。

从和或融合,最新的显微镜成像软件,提供了一个可选的反褶积模块称为ClearView-GPU™。这允许用户同时执行反褶积和数据采集,提供快速的可视化以及deconvolved数据集屏幕和简化用户的工作流。ClearView-GPU™还包括一个预览模式,使即时反馈的影响的一系列反褶积处理选项,并提供控制结果。

的关键特性和或ClearView-GPU™

• 准确的——加速Gibson-Lanni PSF估计算法准确,支持球面像差校正深陷标本
• 强大的——增强GPU-accelerated Richardson-Lucy Jansson-Van Cittert,反滤波算法
• 定量——“节能”比赛总光子原始数据和结果的内容
• 极快——优化CUDA工作流的性能
• 集成——结合收购“实时”的感觉或操作存储数据
• 更清晰的——更好的光学切片和增强对比甚至深陷标本
• 创新少——Richardson-Lucy迭代加速gradient-driven收敛周期

图像形成

图像形成的过程是一个对象的图像通过一个光学系统投射到一个平面的观察或检测:空间分布的光子图像代表发出的光分布,反映,或者从感兴趣的对象。

“卷积”操作描述成像数学;在卷积,从对象收集的光的空间分布与仪器卷积点扩散函数(PSF)。PSF被认为是一个基本属性的物理成像系统空间分辨率和设置一个限制。然而,计算机辅助成像可以跨越这个物理限制使用反褶积等方法处理。衍射的PSF的形状是有限的,通常的瞳孔平面工具。

PSF缩小,空间分辨率增加的(数值)孔径光学系统变得更大。卷积可以被看作是一个模糊的数学描述PSF,正是这种模糊反褶积中寻求“撤销”。

关于荧光显微镜、信噪比和分辨率限制系统的能力来解决一个对象。以下方式可能影响图像中的对象:

• 如果一个物体的荧光强度太接近样品的背景强度或噪声的检测系统,它将不可见
• 如果两个物体相距不到系统的分辨能力,他们将显示为一个对象
• 如果一个对象小于系统的分辨能力,它将出现至少一样大系统的分辨率极限

在下面几节中,反褶积的数学描述,然后在视觉上为了支持一个更直观的理解。傅里叶变换(FT)是一个重要的数学关系依赖于反褶积。英国《金融时报》是一种描述分布一般(时间或空间),由一组或集合的替代功能。

为了转换为英国《金融时报》表示,一系列空间频率的相位和振幅计算描述原始功能。结果是一组对不同空间频率的正弦和余弦,每一对的振幅或强度的常数。

计算改进了这个重要的功能在许多代,现在使用GPU的力量,它可以快速计算。这是事实的话,当分布表达了他们的英国《金融时报》,空间分布的卷积用乘法,而反褶积是由部门表示。很多,简化了计算。

然而,这种简单的关系只适用于理想的无噪声的情况下。对于真正的成像情况,噪声使这更困难,然后使用迭代技术。

这里,简单的情况说明,由探测器接收到的图像可以被认为是由光点的集合,每个已与PSF卷积。作为一个视觉的例子,下面的测试模式的对象可以被视为(图1)。

图1所示。的一个例子真正的物体成像的成像系统。

一旦光通过光学系统和收到的探测器,它已经卷积或模糊的对象出现,如图2所示。

图2。成像系统如何扭曲的一个例子,或缠绕,对象。

图3和图4显示了模糊函数或点扩散函数,它显示了一个3 d和2 d投影视图,分别。图4中的环被称为空气的戒指,并与一个圆形孔径成像系统的特征。

70%的传播能量是包含在中央的亮点和程度的这个地方叫做一个通风的单元,对应1.22 *波长/ NA,波长的发射波长和NA限制孔径的光学成像系统。

图3。一个单点的变形,或点扩散函数(PSF)。在3 d所示。

图4。2 d显示了一个系列的PSF的戒指——被称为“通风模式”——“艾里斑”的中心。

因为它是已知的图像卷积的PSF通过成像系统,这个过程的逆deconvolve形象和恢复信号和分辨率可以应用。

图5。图像卷积和它的逆矩阵的简化解释,反褶积重新创建原始对象。注意,英国《金融时报》代表了傅里叶变换,它允许我们在无噪声的情况下,用乘法来取代卷积和反褶积。因此在上面,我们看到图像形成过程,下面的简化形式和图像恢复或反褶积过程。

奈奎斯特抽样

早在20^th世纪,在数码电子产品的出现,哈利尼奎斯特(和各种其他人)意识到,为了准确地代表一个连续(或模拟)系列离散(或数字)的方式,连续系列的录音,或表示,应该至少有两次的频率。

录音的音频转化为数字格式至少40 kHz的频率(通常是使用44.1赫兹或更大)的日常例子这一现象。这是由于这样的事实:人类听觉系统(模拟录音设备)通常不能够检测频率高于20 kHz。下面的音频记录40 kHz,高频高音会丢失或更糟的是,别名为低,杂散的频率。

记录频率越低,听起来会越糟糕。这可以表示如下:

图6。一个连续信号采样。

红色的线条代表的连续系列记录为数字信号。黑点是记录的频率。因此,虚线是信号的数字表示。显然不同于原来的系列!

这种情况下的一个直观的例子是莫尔条纹中观察到的图像捕获或在低分辨率的大小:

图7。左边的图像没有捕获足够的分辨率和显示工件。

在三维成像的荧光显微镜、图像大小(或多个技术,像素大小)和步长(Z)需要被正确设置。

横向(XY)分辨率的极限可以由著名的阿贝方程:

例如,使用525纳米光和高钠目标,比如1.4石油,这是188海里。

奈奎斯特抽样定理表明,数字采样应该至少有两次这个频率(或距离的一半),或者像素大小(在图像平面上)不应大于94纳米。如果总放大(C-mount和客观)100 x是使用,这相当于9.4µm像素的相机。

以下公式揭示了极限轴向(Z)决议:

η的介质的折射率。

使用相同的示例1.518之前和折射率,这是813海里。

奈奎斯特抽样定理表明,Z-stepµm尺寸应不大于0.4,或406.5海里。

注意:更多的信息可以提供给反褶积处理,更好的最终图像的分辨率和信噪比。

最小的像素尺寸和最小的Z-step应该使用实际成像与通常的限制内的样本可能敏感的漂白和/或光毒性。

融合软件和或可增加抽样的Z-stacks协议偏好和还提供用户选择增加放大透镜(es)蜻蜓系统:

图8。严格的奈奎斯特选择融合软件。

图9。一只蜻蜓系统上使用2 x镜头。

ClearView-GPU™:融合的反褶积模块

图像处理部分包含的和或ClearView-GPU™模块。

如果找到CUDA-compatible GPU和司机,GPU兼容性图标将显示绿色和反褶积处理将高达50倍处理CPU上执行。这两种选择都在融合软件支持。

此外,它包括选择预览区域图像的即时反馈的结果,允许用户调整前处理设置和查看其影响将它们应用到一个完整的数据集。

图10。融合图像处理的反褶积模块选项卡。

图11。立即deconvolved预览允许一个小区域。

算法和点扩散函数

有三个处理算法参与ClearView-GPU™:健壮的、快,最快。每个代表图像质量之间的平衡和处理时间。

• 健壮是一个迭代的最大似然估计量,给最好的结果,也是抵抗图像中的噪声
• 快也是一个迭代方法,并使用货车Cittert方法降低处理时间,通常两倍相比,健壮。
• 最快的是价值和使用一个逆(维纳)滤波器来进一步减少处理时间,又通常两倍相比,快

在所有情况下,处理的数据集分为块GPU (GPU处理定义的内存限制设置渲染菜单的偏好区域融合)。这意味着没有限制大小的数据集,可以deconvolved;然而,更多的GPU内存导致更快的处理时间。

ClearView-GPU™包括5个PSF模型。所有的模型使用一个快速积分器加快Gibson-Lanni算法,用来估计一个健壮的3 d PSF,畸变。目前这是最好的算法用于PSF估计。

• 宽视野荧光
• 旋转磁盘共焦
• Brightfield
• TIRF
• 激光扫描共焦

高级设置

默认设置是经过精心挑选,以确保最好的结果提供了对于大多数图像。如果用户希望调整这些设置,他们可以在反褶积设置部分。建议做这些设置在预览模式的即时更新设置的影响。

图12。融合图像处理的反褶积模块选项卡。

尽管这超出了本文的范围提供了一个全面的解释,最低强度删除相关用户应该禁用该设置如果他们希望保持“节能”,确保原来的光子(像素)数量和加工数据集是相同的差异(< 1%)。

结果

表1。蜻蜓的成像性能的比较宽视野和40μm共焦针孔前后反褶积。测量是用MetroloJ imageJ PSF分析插件。100海里珠子在波长488纳米的激光激发荧光成像,Zyla 4.2 + 1 x尼康相机变焦和60倍/ 1.4计划apo石油镜头,Zμm一步是0.1。应用半宽度的强度谱线轮廓,一个标准的测量的分辨率。

PSF测量	WF	WF +鲜美	迪弗莱40	迪弗莱40 +鲜美
横向应用(nm)	245年	185年	238年	139年
横向(XY)投影
。	。	。	。	。
轴向(Z)投影

图13。轴向经串(规范化)强度的100 nm珠显示信噪比的增加和减少应用反褶积后的决议(增加)宽视野和共焦。

图14。显示完整的领域映像的菊花花粉粒前后反褶积,与合并渠道视为最大强度投影图像。注意deconvolved的对比度和细节增强图像。因为这是一个明亮的健壮的样本,我们可以延长曝光时间250毫秒,实现高信噪比恢复高空间频率反褶积。因此,我们可能会超过阿贝共焦成像的衍射极限。但标本的密度也是一个挑战光学切片,正如在单一光学部分的模糊c .菊花花粉过敏的最大强度投影前后的488年和561年的渠道反褶积与融合、成像与488年和561年激光激发蜻蜓。Zyla 4.2 + 1倍镜头变焦和使用徕卡100 x / 1.44油镜头。突出显示区域所示。

图14 b。(见上图)。从图片显示细节全分辨率。表面清晰度提高清晰度和分辨率改善个人的花粉粒。图14 c(下图)显示单一光学部分从两个渠道菊花花粉Z系列。ClearView-GPU增强对比度,提高光学切片并提供清晰频道分离这么厚的标本。精细结构,墙内的花粉粒变得清晰可见。这些点状的特性在反褶积后的范围150 - 200 nm的半最大值宽度。酒吧是2μm规模。

图15。盐水虾尾捕获40µm针孔蜻蜓。目标是63 x1.4。相机是Zyla 4.2 + sCMOS额外的1.5倍放大镜头蜻蜓。突出显示区域显示在图16之前和之后ClearView-GPU™反褶积

图16。共焦(左上);deconvolved(右上角)和线剖面(下)显示提高信噪比和横向分辨率。注意到烟雾沿着线路纵断面共焦图像变得清晰分离的反褶积后四个不同的对象。

速度比较

和或ClearView-GPU™设计保证最高速度与最大可能的数据和功能。

使用相同的硬件和尽可能类似的设置,ClearView-GPU™已经被证明是比其他主要GPU-accelerated包快10倍和50 x比CPU-based方法,特别是对于大数据集,即使迭代加速是禁用的。

图17。共焦(左上);deconvolved(右上角)和线剖面(下)显示提高信噪比和横向分辨率。注意到烟雾沿着线路纵断面共焦图像变得清晰分离的反褶积后四个不同的对象。

应用实例

除了明显的视觉的反褶积如上所述,一个更强大的优势是如何提高能力准确地分析图像使用广泛的工具提供给研究人员。

最空间守恒的数据(对比度最高和最清晰的边界)调查所需的目标元素达到最准确的分析,是一个简单的点对点的测量,或更高级的亚细胞结构的自动识别和潜在的跟踪它。

下面的泡跟踪(图18)是一个良好的工作的例子,比如在癌症研究自噬模型。囊泡的大小在于一微米或更小的范围,并且可以小于纯光学系统的分辨率没有反褶积。此外,他们还可以密集和快速行动在三维体积。

反褶积可以大大增强的能力,谨慎地检测单个囊泡和允许专用软件分析模块(例如伊万里瓷器LineageTracker)等参数的自动检测和分析他们的方向,数量,距离和速度的运动(图19)。

图18。比较样本的标签泡使用蜻蜓共焦成像模式(a, C和E)和后ClearView-GPUTM反褶积(B, D和F)。C和D显示放大区域分别为a和B,在这些地区,集群的囊泡中更清晰的看到deconvolved图像(D)与原始共焦图像(C), E和F是正交的(x, z)视图展示与高对比度较小直径的概要文件deconvolved形象(F)由于分配的光省略了从每个泡回到它的起源。

讨论

本文展示了如何使用ClearView-GPU™反褶积提高分辨率在所有三个维度,超过了阿贝限制在某些情况下。它还增加了所有成像方法的信噪比。没有以前的变得清晰分离的功能。

考虑现代gpu的力量上可用的存储空间和最新的工作站,和或的ClearView-GPU™反褶积可以应用到每一个数据集的成像系统。

使用和或ClearView-GPU™和融合软件,反褶积能并行地发生在图像采集或后处理步骤,如果需要的话。

原始数据并不像deconvolved数据改变除了产生,而不是取代,可应用于定量研究如果节能保证使用高级设置。

源和进一步阅读

• Castleman, 1979;Agard塞达特,1983;Agard et al ., 1989
• 图像Pluke——自己的工作、CC0https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=18423591
• 3.0 CC冲锋队,https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=644816
• 詹姆斯Pawley生物共焦显微镜检查手册》第三版,第1章,施普林格,2006年
• 美国f·吉布森,f•兰尼“实验测试分析模型的油浸物镜的像差用于三维光学显微镜、“J选择Soc(一)1991年10月,8(10):1601 - 13所示。
• 公共广播简颂“反褶积的图像和光谱”,第二版,多佛出版物,学术出版社,1997年,ISBN-13: 978-0-486-45325-5

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