等温滴定量热法(ITC)是其中一个最强劲的热力学和方便的技术来研究分子间的相互作用通过检测任何反应热量发生在ITC细胞(1 - 9)。ITC亲和力提供有益的信息绑定,绑定化学计量学和机制,推动力量,(de)水化(de)的质子化作用,相互作用的表面区域,与盐相互作用和分子的灵活性,如蛋白质动力学(1 - 8、10 - 15)。ITC遵循Michaelis-Menten动力学的能力[16]、水解[17],估计汇率(即。协会和离解率)的分子相互作用[18]另外扩展了ITC一系列生物系统的效用。
在过去的10年中,两个ITC仪器,VP-ITC (MicroCal™,莫尔文Panalytical,英国莫尔文Panalytical)和ITC200 (MicroCal™,英国)有明显导致热力学研究分子关联。莫尔文Panalytical PEAQ-ITC (MicroCal™,英国)最近出现的一种新的模式ITC仪器与提高灵敏度,更方便清洗模块,方便分析软件[19]。因此,MicroCal PEAQ-ITC也预测为绑定能量的理解和扩展ITC的应用。
以获得准确和精确的ITC温谱图和数据,准确的理解程序用于ITC实验是必要的。几个综合手册PEAQ-ITC非常有用的和可用的[20]有关如何有效的实现信息进行试验和检查数据。下面的文章将提供实用和ITC的关键技巧基于作者的经验更好的性能的实验PEAQ-ITC及其分析,这里不做介绍。
气泡的形成
一个更小的细胞体积PEAQ-ITC仪器(大约0.2毫升)比VP-ITC仪器(大约1.42毫升)是非常有益的;它减少所需的样品和实验时间,使热量的测量使用VP-ITC变化不明显的观察到,如相关的热稀释高浓度的盐(图1)。
分子间相互作用与低亲和力需要ITC滴定高摩尔比率,而应该使用大量的样本。快速平衡和测量最大化ITC的数量测量计算标准差和前景分析各种样品和条件在一个特定的时期。这些好处也在ITC高效研究使用aggregation-prone样品减少用于聚合的时间。此外,较小的细胞体积PEAQ-ITC仪器是可行的减少潜在的聚合成核。然而,许多问题时可能会遇到执行PEAQ-ITC体积小于VP-ITC,如下解释。
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图1所示。热滴定的高浓度的氯化钠由不同型号的ITC监控仪器。ITC热分析图1 M氯化钠在10 M盐酸滴定的解决方案在ITC滴定注射器蛋白质在10 M盐酸溶液在ITC细胞记录使用VP-ITC(左)和PEAQ-ITC仪器(右)。ITC山峰后最后滴定的插图所示红色和放大比较。摩尔浓度的氯化钠每次滴定VP-ITC和PEAQITC测量是相同的。第一次滴定的滴定体积是2µL和20µL其他使用VP-ITC滴定,第一滴定和2.2和0.8µLµL其他使用PEAQ-ITC滴定
清除余下的泡沫细胞(ITC)
在ITC实验数据获得的小细胞体积PEAQITC仪器将会影响更多的泡沫细胞的存在和发展,它可以产生峰值和低基线,基线比将使用VP-ITC实验仪器。因此,细胞间隙的泡沫定期执行。然而,用户可能会觉得不容易加载一个体积小的解决方案到PEAQ-ITC细胞使用装入注射器排除气泡,主要是那些熟悉VP-ITC,大概有7倍大细胞体积。
强大的清除(即。,快速加载)可以样品溶液飞溅,造成样品损失。然而,弱清除(即。,低负荷)不会成功地驱逐泡沫。因此,将溶液注入细胞必须尽可能温柔地执行没有飞溅示例解决方案。旋转加载注射器是退出也有利于避免泡沫。额外的灯光或灯光帮助检测泡沫,没有光的细胞单位。
装船时特别注意鼓励和清除颜色的样品,颜色,特别是在相对较高的浓度,可以阻碍的观察泡沫,也当泡沫样品表面活性剂等工作。实验中使用彩色膜蛋白surfactant-containing解决方案就是典型的例子。短时间内使用台式离心机离心分离和/或脱气是有效规避泡沫的生成。
重复插入和删除滴定的注射器可能最后一步保证没有气泡的样品溶液在ITC细胞。如果一个人观察到嘈杂的ITC温谱图在平衡或延迟,停止测量,重复插入和删除一个滴定注射器。
清除余下的泡沫(ITC(滴定)注射器)
滴定的注射器的体积PEAQ-ITC仪器(大约40µL)也小于VP-ITC的仪器(大约280µL)。因此,泡沫在滴定剩余的注射器PEAQ-ITC仪器可能会影响滴定的精确和准确的体积超过VP-ITC。如果检测到泡沫,按“柱塞/续杯”按钮放置在仪器控制栏底部的MicroCal PEAQ-ITC控制软件窗口并尝试删除它们。短的离心和/或脱气是有效避免泡沫的发展。
当泡沫持续下去,实现以下过程通过调节几个主要函数的ITC滴定注射器在仪器控制栏:
即按“柱塞下降”按钮清空滴定注射器
二世。按下“加载”按钮
注1:“加载”功能是推荐的,因为它是伴随着脱气,这是有效消除泡沫
注2:“打开填补端口”→“柱塞下降”通常是有效的之前,执行“加载”功能
三世。如果泡沫不移除,I和II重复过程。
第四。如果上述方法不工作,舒张期经历了短暂离心的样品用台式离心机和/或脱气。检查冲头和考虑改变后,它已被用于在200 - 300年ITC测量。
如果一个计划使用相同的样本在滴定注射器后续ITC测量,可以填满滴定注射器相同的样本没有清洗或冲洗注射器(即。,只需洗细胞)。冲洗后针的滴定注射器与工作方案和擦拭它,按“柱塞下降”按钮,然后“加载”按钮。这是一个有效的方法来加载示例没有添加泡沫;然而,谨慎是aggregation-prone所需样品。
在ITC细胞残留的解决方案
用户通常使用缓冲溶液冲洗ITC细胞,不分析物的组成。这是一个基本和关键过程匹配解决方案组件解决方案之间的细胞和注射器,因此减少背景(即热。、控制热量)。然而,在实践中很难消除单元中的所有剩余的解决方案使用加载注射器。剩余的解决方案的影响的细胞PEAQ-ITC仪器上分析物的浓度的变化会比那些VP-ITC乐器,由于细胞体积比较小,前者,而后者。
分析使用一个不合适的样本浓度将妥协的评估亲和常数(协会和离解常数),n值,和其他热力学参数,包括(Δ熵的变化年代)、焓(ΔH)和吉布斯自由能(ΔG)具有准确性高、重现性好。以最小化这个问题,建议细胞与工作样品溶液冲洗,冲洗后用analyte-free缓冲溶液。
剩余的样品溶液在一个单元中水库
以加载示例解决方案和执行后续注入消除泡沫,装入注射器插入细胞是一个必要的过程,放出样品溶液对应的体积装注射器的针头。如果样品溶液保持在一个单元中水库之前加载注射器,细胞将样品溶液。
清洁的重要性细胞水库和吸管锁紧螺母
PEAQ-ITC仪器系统的清洗系统,主要包括细胞单位,清洗模块和控制器PC,高效和鲁棒性。然而,粘样品可能在细胞储层和底部的锁紧螺母的吸管。因此,清洁细胞的水库和底部的锁紧螺母为宜,以确保清洁ITC温谱图和成功的分析(图2)。
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图2。插图的锁紧螺母PEAQ-ITC吸管单位。锁紧螺母用箭头指示和标签。
清洗和冲洗错误故障排除
PEAQ-ITC系统敏感和直观。因此,感官系统中的任何不足,创造了许多区分大小写错误消息。关于清洁步骤出现错误消息时,明智地验证限制的瓶,每个连接的液体,大量的解决方案在每个瓶子(鲜美14%或20% Contrad™70年,加倍的去离子水,(DDW)中所描述的和甲醇(高效液相色谱级或纯> 99%),和液体废物)清洗模块,以及细胞之间的连接单元,清洗模块和控制器PC。
各种各样的技巧
- 恢复剩余样本滴定注射器通过单击“柱塞下降”按钮在仪器控制栏,清洗后的滴定注射器使用工作的解决方案。
- 冲洗的滴定注射器使用工作方案和擦提示尽可能快速,轻轻的,小心不要损坏滴定的针注射器之前ITC滴定注射器插入ITC细胞。否则,滴定液将提前与分析物反应ITC的实验。这个过程变得更加关键当滴定液的浓度非常高。
- 给参考细胞注入DDW之前,保证细胞水库是干净的,否则DDW参考细胞可能被污染的DDW将溢出的参比电池再充填。保持细胞单位清洁是ITC的先决条件。
引用
1。Jelesarov, h . r ., i和博斯哈德(1999)等温滴定量热法和差示扫描量热法研究生物分子识别的能量补充工具。J摩尔Recognit12,3-18
2。皮尔斯,M . M。、拉曼、c . s和纳尔,b . t .(1999)等温滴定量热法的蛋白质相互作用。方法19,213 - 221
3所示。莱维特,s和Freire,大肠(2001)直接测量的蛋白质绑定能量通过等温滴定量热法。当今结构生物学观点》11,560 - 566
4所示。Ladbury, j·e·威廉姆斯,m . a(2004)扩展接口:测量非本地生物分子相互作用的影响。当今结构生物学观点》14,562 - 569
5。委拉斯凯兹Campoy, a和Freire,大肠(2005)ITC后基因时代……?无价的。Biophys化学115年,115 - 124
6。Ladbury, j . e .(2010)量热法作为一种工具来理解生物分子相互作用和药物设计的援助。物化学Soc反式38,888 - 893
7所示。李,y . H。Ikegami, T。史坦利,d . M。樱井,K。哈泽,T。and Goto, Y. (2011) Binding energetics of ferredoxin-NADP+与铁氧还蛋白还原酶及其与功能的关系。Chembiochem12,2062 - 2070
8。金,j . Y。中山,M。、丰田、H。Kurisu, G。and Hase, T. (2016) Structural and mutational studies of an electron transfer complex of maize sulfite reductase and ferredoxin. J Biochem160年,101 - 109
9。金,j . Y。木下光男,M。、Kume年代。托马斯,h·G。Sugiki, T。Ladbury, j·E。小岛,C。Ikegami, T。Kurisu, G。Goto, Y。et al。(2016)共价的部队调优电子传递复杂的铁氧还蛋白和亚硫酸盐还原酶优化酶活性之间的关系。物化学J473年,3837 - 3854
10。Markova:哈伦,d .(2004)的发展连续等温滴定热量平衡方法研究。学生物化学肛门331年,77 - 88
11。奥尔森,t·S。威廉姆斯,m。皮特,w . r . Ladbury, j . e . (2008) protein-ligand交互和溶解的热力学:配体设计的见解。J杂志384年,1002 - 1017
12。时代,一个。只是,H。宫本茂,Y。井上,K。、Kume年代。李,y . H。野田佳彦,M。中山教授,S。Shimamoto S。Nishimura S。et al。(2012)水溶性差的化合物药物输送系统使用lipocalin-type前列腺素D合酶。J控制释放159年,143 - 150
13。Kume, S。李,y . H。宫本茂,Y。广岛市东北方,H。Goto, Y。and Inui, T. (2012) Systematic interaction analysis of human lipocalin-type prostaglandin D synthase with small lipophilic ligands. Biochem J446年,279 - 289
14。Kume, S。李,y . H。Nakatsuji, M。Teraoka, Y。山口,K。Goto, Y。and Inui, T. (2014) Fine-tuned broad binding capability of human lipocalin-type prostaglandin D synthase for various small lipophilic ligands. FEBS Lett588年,962 - 969
15。木下光男,M。金,j . Y。、Kume年代。神,Y。Sugiki, T。小岛,C。Kurisu, G。Ikegami, T。哈泽,T。Kimata-Ariga, Y。et al。(2015)理化性质的接口控制铁氧还蛋白辅酶ii (+通过其interprotein)还原酶活性与铁氧还蛋白相互作用。Biochim Biophys学报1847年,1200 - 1211
16。托德·m·j·戈麦斯,j .(2001)酶动力学决定使用量热法:一般为酶活性测定?学生物化学肛门296年,179 - 187
17所示。Maximova、k和Trylska j . (2015) trypsin-catalyzed水解动力学由等温滴定量热法。学生物化学肛门486年24到34,
18岁。范德Meulen, k。霍洛维茨,S。Trievel, r . c和屠夫,s . e .(2016)测量分子的动力学协会通过等温滴定量热法。方法Enzymol567年,181 - 213
19所示。http://www.malvern.com/en/products/product-range/microcal-range/microcal-itc-range/microcal-peaq-itc-range/default.aspx
20.http://www.malvern.com/
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