在共焦拉曼成像,收购时间一个拉曼光谱是一个重要的价值,因为它会影响图像的采集时间通常包含成千上万的拉曼光谱。本文展示了如何使用一个光谱EMCCD探测器来大大减少采购时间到几毫秒每光谱以及整个灵敏度大大提高。
共焦显微镜工作原理
一个点光源(激光)使用共焦显微镜聚焦到样品。反射的光(荧光)通常是收集相同的目标,然后集中到一个针孔的探测器。这只确保光成像焦平面到达探测器,强劲增加图像对比度和,以适当的针孔大小的选择,有点提高了分辨率。
在共焦拉曼成像alpha300 R系统这对这里描述的实验,采用独家过滤器是用来抑制反射的激光同时允许被探测到的拉曼散射光光谱仪和CCD相机。为了实现一个图像,成千上万的光谱与通常在很短的时间内获得不到100毫秒为每个光谱积分时间。
由于拉曼散射截面是非常小和励磁功率仅限于几毫瓦,一个人怎么能改善共焦拉曼系统的总体敏感性?
优化信噪比改善CRM系统的总体敏感性
重要的是要优化信噪比(S / N)。第一步是提高收集到的拉曼信号,这可以通过优化谱仪、显微镜的吞吐量和利用客观高数值孔径(NA)。共焦设置,减少不必要的背景信号从失焦地区和S / N进一步改善。
使用一个合适的探测器灵敏度最高的
下一个是选择一个合适的探测器灵敏度最高的,例如背景CCD,量子效率超过90%。读出噪声和暗噪声探测器本身的噪声的主要来源。目标应该是消除所有的其他噪声来源,所以光子散粒噪声是唯一一个仍然存在。
由于光子遵循泊松统计,对于一个给定的信号的不确定性是电子信号的平方根。在缺乏其它来源的噪音,S / N不能大于10 100电子的一个信号。
黑暗的CCD的噪声降低了冷却效率
暗噪声是由于CCD热生成的运营商,可以大大减少通过CCD的有效冷却。一个好的CCD热暗电流小于0.01电子/像素/秒-60°C。因此,没有必要酷-60°C以下集成的几秒钟。在共焦拉曼设置,暗电流完全可以忽略小于100 ms的集成。读出噪声生成而改变收集电子成数字计数和受到CCD读出放大器的质量和速度(数字化)读出的过程。相机制造商指定读出噪声,给出了电子。50 kHz的典型值是5 - 10电子读出速率为2.5 MHz大约30电子读出率。
读出噪声限制
据说信号读出噪声有限如果读出噪声超过光子散粒噪声。在通常的光谱实验中,积分时间是增加获得足够的信号,以确保信号散射噪声又有限。然而,这并不总是可能的共焦拉曼显微镜。
如果一幅图像组成的128像素/线和128行获得的积分时间/频谱是1秒,总收购时间将4、5个小时,这是减少到少于30分钟的积分时间100毫秒或少于3分钟10 ms的积分时间。然而,探测器的读出越快,越嘈杂的读出放大器。
装有50 kHz的1024 x128像素CCD读出放大器可以在大约22女士,也恰好是最短的积分时间。假设读出噪声的10个电子,每个信号低于100 /像素读出电子有限公司(泊松噪声<读出噪声)。快速读出放大器,如果读出噪声是30电子信号然后甚至900电子(光子~ 1000 /像素探测器)将读出有限。
一个电子倍增CCD是什么
电子倍增CCD (EMCCD)是一个标准的CCD额外读出寄存器与更高的时钟驱动电压比普通CCD读出寄存器。由于时钟这么高的电压,通过碰撞电离电子乘法是获得一个可调的总放大1000倍的信号。使用此设置,上面的信号可以被放大读出噪声,信噪比总是限制的泊松噪声信号,即使有一个快速的读出放大器的使用。作为一个例子,一个1600 x 200像素EMCCD 2.5 MHz读出放大器,用于实验在这篇文章中,可以读出在2.3毫秒。
计算结果显示改进S / N对不同的信号
计算下面给出证明改进的S / N可以预期不同的信号。假设CCD量子效率90%(量化宽松政策),信号放大被设置为一个值,一个a / D数等于电子数的读出噪声(1 a / D数= 30电子为2.5 MHz读出放大器)。
如果100个光子落在CCD像素在一个指定的积分时间,90电子将生成和转换为3 a / D。泊松噪声将是9.5,0.3 A / D计数,读出噪声将1 A / D计数。这些数字,S / N比率大约是2.6。
EMCCD,电子增益系数相乘信号可以将高达1000人。一般来说,一个更小的放大系数将被使用,但它不产生影响的计算,90年电子将被放大到90000电子导致3000 a / D。泊松噪声是9500电子转换为317项,同时1计数读出噪声完全可以忽略不计。S / N是9.5,这是一个提高3.6倍。
如果信号是10光子,这将导致一个信号只有0.3项的标准CCD,但泊松噪声可以忽略。1计数读出噪声、S / N是只有0.3很难探测信号。EMCCD,信号333和泊松噪声是100数量提供S / N(3.3 - 11次普通CCD的改进。
实际上,电子倍增过程本身增加了一个额外的,所谓的过剩噪声系数约为1.4,所以真正的改进S / N是减少到2.6和7.9,分别为上述例子。
在更高的信号的情况下,信号强度不再是读出有限,多余的电磁过程的噪声系数降低了EMCCD的S / N比率小于正常CCD。这里,EM寄存器可以关掉,可以使用“正常”读出寄存器。因此,EMCCD的作品就像一个黑色背景CCD。
共焦拉曼聚合物样品的图片
图1所示三个共焦拉曼的图像采用溶胶薄膜,spin-coated玻璃衬底上。中间的图片,用金属针垂直划痕是为了消除有机层。膜厚度,决定了AFM在这,是7.1海里。也被认为有一个额外的污染层厚度4.2 nm。起初,这个污染层的物质组成和来源不清楚,但可以建立的共焦拉曼测量。
图1所示。(一)- 7.1 (c)的共焦拉曼图像获得的纳米薄层有机玻璃CH2伸展带大约3000 /厘米。比例尺:10µm。(d)示意图的样本30 x 50µm = 8000 100 x 80像素光谱,110 ms /频谱。
获取图像、200 x 200拉曼光谱在50 x 50 mm扫描范围和CH2拉伸的强度的PMMA集成3000 /厘米。励磁电源使用100 x 20 mW @532 nm, NA = 0.9的目标。图1一个收购正常背景(BI) CCD使用62 kHz的读出放大器和集成时间/频谱36女士。稍微发挥一点想象力,抓中间的图片是明显的,但信噪比远小于1。
如图1 b是相同的部分样本成像EMCCD获得约250。图像显示几乎相同的S / N,但现在的积分时间是3.6毫秒,10倍的速度比在图片1。图片1,完成图像采集了25分钟,但是图像1 b仅用了3.4分钟。图1 c EMCCD的收购,但现在用同样的积分时间如图1所示。在起跑线上可以清楚的看到,污染的形式在玻璃表面和PMMA针状的结构,这将在稍后讨论。示例如图1所示的草图。
对于接下来的一组照片,一个油浸物镜和NA = 1.4使用样例被搞得天翻地覆。集成时间是7 ms /频谱导致总收购时间5.4分钟(包括0.3 s / back-scan线)。十二个图像在相同条件下获得不同的增益设置从16 x 1000 x如图2所示。再一次,获得的图像是通过整合CH2伸展带周围的信号。从图片可以看出,信噪比强烈增加增益设置大约200 x。上面,没有更多的S / N是改善图像。
图2。比较共焦拉曼EMCCD获得的图像获得不同的设置。
在图3中,信号的信噪比的CH2伸展带PMMA策划反对EMCCD增益。信号的标准偏差作为噪音。可以看到,增加信号的增益设置300 x,这似乎是最佳设置但又高于这个值S / N值略有减少。使用适当的增益系数,改进是超过5倍。
图3。信噪比的信号CH2拉伸的PMMA策划反对EMCCD增益。
污染物的识别
没有一个光谱获得的纯PMMA光谱或纯光谱污染层,因为有限的共焦深度分辨率。然而,纯玻璃光谱被平均收购所有光谱获得的擦伤的面积没有任何污染。
纯PMMA和污染光谱可以被减去计算玻璃光谱的PMMA光谱和光谱的污染,分别。这些光谱为基础分析,考虑在每个测量光谱拟合的线性组合基本的光谱。
使用此方法,三个图像分布的三个组件(PMMA,玻璃,和污染)可以实现的彩色(红色= PMMA,蓝色=玻璃、和绿色=污染)来查看他们的分布(图4)。
图4。彩色图像共焦拉曼7.1 nm的PMMA层(红色)和4.2纳米污染层玻璃(蓝色)(绿色)。女士7,200 x 200光谱积分时间/频谱。总收购时间5.4分钟。
不同组件的光谱图5所示。为了更好的比较,它们有相同的最大强度。关于玻璃光谱、PMMA谱放大约20倍,污染范围放大15倍左右。
图5。拉曼光谱的计算拉曼测量在图4中,显示相同的最大强度。规模只有纠正PMMA。体系光谱放大20倍左右,污染光谱对玻璃光谱约15倍。
从这个,绿色的光谱(污染)可以很容易地认为是烷烃。调查AFM厚度、样品制备了前几周的聚苯乙烯(PS)拉曼测量和保存在一个容器中。PS容器是由注塑模具是涂以烷烃为更好的分离。由于样本(可能存储在一个温暖的环境),烷烃的一部分蒸发和凝结样本,这解释了针状的结构和被涂料覆盖。
规模在图5是正确的PMMA,揭示最多只是28项。完整的信号平均CH2拉伸政权(约150像素或330 /厘米)是1965。EM增益测量大约是600 x,因此1965项对应于每CCD像素和99年1.4光子最大电子光子(110)总!然而,如何获得一个好的电子拉曼光谱有这么少?原因是大约平均20000光谱测量体系光谱如图5所示。因此,整个信号是20000倍。
相反,只有那些光谱被收购,PMMA在场。为此,每个光谱信号必须足够强大的PMMA分布拉曼形象,这将使它容易选择正确的平均光谱。可以观察到,1.4光子EMCCD像素足以视图PMMA层的分布在这种情况下,选择正确的平均光谱的过程。
如果一个衬底没有任何背景信号的CH2拉伸政权已经使用,那么结果将是更令人印象深刻。三种光谱的PMMA、玻璃和烷烃与相同强度如图6所示。
图6。在图5光谱一样,但正确的规模。
使用的玻璃衬底可以看到,有一个小拉曼峰值约有三分之一的烷烃信号和大约一半的PMMA在这个区域的信号。很明显,confocality detectibility的拉曼系统是重要的薄层。即使在最合适的共焦设置,深度不小于500纳米的信息,意味着500海里的玻璃导致拉曼信号。自拉曼信号成正比的材料数量,一个典型的(non-confocal)设置将收集玻璃信号超过300倍(170µm覆盖玻璃厚度),使它无法检测薄涂料层即使在相对更长的积分时间。
总结
结果表明,使用一个EMCCD相机可显著提高速度和检测效率,特别是对于短期集成时代需要用共焦拉曼显微镜。7.1 nm PMMA的分布和4.2 nm烷烃层玻璃衬底上可以很容易地发现和认同的积分时间只有7女士对于每个谱,减少整体收购时间为200 x 200 5.4分钟(= 40000)共焦拉曼光谱图像。
非常小的信号由CCD读出噪声,EMCCD相机的使用可以提高信噪比的5 - 10倍相比,CCD的最好标准。对于较大的信号,电子相乘电路可以简单地关闭和正常的所有属性(背景)CCD维护。
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