利用UHP-SEC光散射对聚合物进行表征gydF4y2Ba

UHP-SEC已成为分析合成聚合物的首选技术。大大减少了样品/溶剂的消耗，以及运行时间，提供了相当大的时间和成本节约效益。考虑到分离中更好的分辨率以及由此带来的低聚物和单体定量的提高，再加上根据需要返回标准GPC的灵活性，转向高产UHP-SEC系统的理由是显而易见的。gydF4y2Ba

分析UHP-SEC的缺陷gydF4y2Ba

尽管UHP-SEC具有明显的优势，但仍有许多缺点需要解决。第一个缺点是柱校准曲线的隐含假设:不同的洗脱时间本质上意味着不同的摩尔质量，摩尔质量的减少对应于洗脱时间的增加。考虑到这个逻辑，一个狭窄的标准会洗脱在一个非常窄的峰，实际上比固有的展宽更窄，因为有限的柱体积。事实上，即使是一个很窄的标准洗脱液，其宽度——假设，通过柱校准——也至少相当于摩尔质量的两到四倍跨度。gydF4y2Ba

表面化学是第二个缺点:当改进分离方法时，应发现待测样品和参考标记物与柱填料理想地相互作用(例如通过电荷或疏水相互作用)的条件。这是因为柱的校准依赖于样品和参考分子与柱只发生理想(空间)相互作用的假设，任何额外的“粘性”将导致不准确的结果。gydF4y2Ba

与HPLC-SEC色谱柱相比，UHP-SEC用于方法优化的表面化学成分相对较少，因此该方法不完全优化的可能性较高。第三个缺点是色谱条件下的柱漂移和蠕变:在如此快速的分离条件下，即使样品加载、柱老化或泵操作条件的变化导致洗脱时间的微小变化，也会导致估计分子量的相对较大误差。gydF4y2Ba

解决方法:光散射gydF4y2Ba

在线多角度光散射(MALS)gydF4y2Ba^{1，2gydF4y2Ba}可以确定聚合物的摩尔质量在每个洗脱体积，绝对，没有参考保留时间。这种技术是通过摩尔质量(M)、散射强度(I)之间的第一性原理物理关系来实现的gydF4y2Ba_{散射gydF4y2Ba})、散射角θ和浓度(c):gydF4y2Ba

情商。gydF4y2Ba

对于任何给定溶剂中的聚合物，dn/dc是已知的或容易测量的，P(θ)是一个依赖于分子rms半径rgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba， K为比例常数，可由测量系统的特性如激光波长来测量。因此，测量c和IgydF4y2Ba_{散射gydF4y2Ba}直接得到r的值gydF4y2Ba_ggydF4y2BaM，当溶液通过MALS检测器的流池时连续。分子量的测定与形状、构象以及洗脱性质无关。gydF4y2Ba

由于这些原因，SEC-MALS，利用OptilabgydF4y2Ba^®gydF4y2BaT-rEX差示折射仪和DAWNgydF4y2Ba^®gydF4y2BaMALS检测器，传统上是严格分析由标准HPLC-SEC分离的溶液中的聚合物和蛋白质的金标准。一个SEC-MALS系统，包含一个内置的gydF4y2BaWyattQELS™动态光散射(DLS)模块，gydF4y2Ba增加了第二种独立测定分子大小(流体力学半径)的方法。使用visstar III在线测量特性粘度是确定聚合物流体力学半径的另一种方法。通过进一步分析分子大小和摩尔质量之间的关系，可以确定聚合物的构象，如无规卷曲、伸长或分枝。gydF4y2Ba

的OptilabgydF4y2Ba^®gydF4y2BaUT-rEX折射率探测器和μDAWNgydF4y2Ba^®gydF4y2BaMALS探测器UHP-SECgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba赋予嵌入式DLS和MALS的优点在更新的分离技术。UHP-SEC- mals，也被称为“μSEC-MALS™”商标，保留了UHP-SEC的主要优势，同时保持色谱分辨率，并提供洗脱物种的绝对分子大小和重量。gydF4y2Ba

图1显示了μSEC-MALS的意义，显示了两个进样体积的30 kDa聚苯乙烯标准品的色谱图。基于洗脱时间的色谱图解释经验表明，50 μL注射液中所含的物种主要比4 μL注射液中所含的物种小。这也暗示了一个较宽的摩尔质量范围，分别覆盖20-40 kDa或10-40 kDa;然而，MALS分析显示，两种注射都包含在30 kDa左右的狭窄分布。gydF4y2Ba

图1所示。gydF4y2Ba用由光散射得到的摩尔质量覆盖的UHP-SEC洗脱两次注射的30 kDa聚苯乙烯(4和50 μL)与宽而不同的摩尔质量范围隐含的柱校准相反，MALS证明两者都包含约30 kDa的窄分布。gydF4y2Ba

所有已知和未知gydF4y2Ba

根据普遍接受的标准验证不熟悉的技术总是有用的，甚至是必要的。这些标准是用于UHP-SEC的线性聚苯乙烯，SEC-MALS对一系列聚苯乙烯标准的分析是相当丰富的。由光散射得到的摩尔质量与柱标定曲线完全吻合，如图2a所示。然而，大多数峰的平坦MALS结果清楚地表明，这些聚苯乙烯标准是相对均匀的，这是不能建立单独的柱校准。gydF4y2Ba

图2。gydF4y2Ba(a)一系列线性聚苯乙烯标准品的叠加色谱图。MALS分析表明，计算的分子量与标定曲线高度对应，并提供了每个峰内的真实均匀性。(b)一系列PMMA样品的叠加色谱图。MALS分析显示了各峰的分枝构象和内部不均一性与柱定标的偏差。每个峰的异质性。gydF4y2Ba

另一方面，由于存在分支，PMMA的洗脱液与线性聚苯乙烯有很大的不同。如图2b所示，对于这些名义上“未知”的样品，MALS测量的摩尔质量并不像聚苯乙烯标准那样彼此完全一致，而且每个峰都是相当多分散的。然而，MALS给出了一个完整的图景，在整个范围内，精确的摩尔质量和分布从数亿到数百万g/mol。gydF4y2Ba

SEC-MALS与μSEC-MALSgydF4y2Ba

根据标准来验证新方法是很重要的，将其与旧技术进行比较也是很重要的。多年来，SEC-MALS一直是评估聚合物摩尔质量和大小的事实上的标准。当前μSEC-MALS仪器覆盖整个范围的UHP-SEC色谱柱(MW: 300da - 10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaDa用于线性聚合物，rms半径:10 nm - 50 nm)，尽管它不能覆盖标准SEC-MALS的整个尺寸范围(MW: 300 Da - 10gydF4y2Ba^9gydF4y2BaDa，均方根半径:10 nm - 500 nm)。交叉验证结果表明，μSEC-MALS与SEC-MALS具有良好的一致性。考虑到高压下紧密填充的UHP-SEC柱上剪切聚合物的可能性，这一对比尤其具有启意义。gydF4y2Ba

图3显示的是1.5 MDa聚苯乙烯样品的分析，用μSEC-MALS(红色，早期洗脱色谱图)和SEC-MALS(绿色，晚期洗脱色谱图)表征，流速均为0.5 mL/min。在这两种分析中，重量平均摩尔质量精确地得到(1.56±0.01)x 10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaG /mol, z-average RMS半径在63.0 nm和61.5 nm处基本一致。因此，可以得出这样的结论:至少在这些条件下，剪切不会发生。在更高流速下的剪切潜力还有待测试。gydF4y2Ba

图3。gydF4y2Ba1.5 MDa MW聚合物的SEC-MALS(绿色，后期洗脱)和UHP-SEC-MALS(红色，早期洗脱)色谱图，均为0.5 mL/min。MALS对重量平均摩尔质量和z平均rms半径的分析表明，与标准GPC色谱柱相比，UHP-SEC色谱柱没有降解。gydF4y2Ba

非线性构象-不是障碍gydF4y2Ba

聚合物的构象有很多种，如无规线圈、棒状和分枝状。每种构象表示的流体动力体积与摩尔质量的关系不同，因此洗脱体积与摩尔质量的关系也不同。gydF4y2Ba

有些环氧树脂，不像聚苯乙烯或PMMA，是拉长和坚硬的，就像刚性棒。这些环氧树脂的伸长形状产生了相对较大的流体力学体积，因此对于给定的摩尔质量，它们比这两种大分子更早洗脱。gydF4y2Ba

如图4a所示为这三种聚合物对应的三个UHP-SEC色谱图，以及μSEC-MALS测量的摩尔质量。虽然这一特定的PMMA样品分枝不严重，其摩尔质量/洗脱体积关系仅与聚苯乙烯稍有偏差，但环氧树脂(EP)与其他两种树脂有明显区别。在每个洗脱体积下，EP的摩尔质量大约比相应的聚苯乙烯物种低40-50%。gydF4y2Ba

洗脱行为的不同是构象不同的直接结果。虽然这种差异不会被标准的分析SEC识别，但它被强调并立即被MALS显示出来，并建立了实际的摩尔质量值。gydF4y2Ba

两个EP样品的重叠摩尔质量值和色谱图如图4b所示。这些环氧树脂在色谱上的摩尔质量几乎完全匹配，表明它们具有相同的构象，尽管它们跨越不同的范围和具有相对不同的分布形状。表1列出了矩和多分散度值，这表明每个样本都有很好的重复性。gydF4y2Ba

共聚物的分析是聚合物表征中最困难的任务之一。由于没有良好的特征，狭窄的参考标准，这些相对异质的配合物，SEC分析与柱校准是不可能的。gydF4y2Ba

分析共聚物最常用的方法是结合UV、MALS和dRI的三重检测gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba．两个独立的浓度信号的组合足以建立衡量dn /直流值和共聚物比随后插入光散射方程(Eq。1),找出每个组件的摩尔质量的复杂以及整体的摩尔质量。共聚物分析三重检测系统的所有主要组件都很容易获得，并以UHP-SEC格式很好地结合:UHPLC泵和柱以及在线RI, UV和MALS检测器。因此，建立的SEC-MALS标准方法可以很容易地推广到μSEC-MALS。gydF4y2Ba

图4。gydF4y2Baa）通过μsec-mηs的刚性，棒状环氧树脂（Ep）与线性聚苯乙烯（ps）或略微支链pMma的洗脱行为。在每个洗脱体积下，PS和PMMA的摩尔质量相当相似，而EP的摩尔质量明显较低，这是由于其刚性棒状构象的结果。b）两个环氧树脂样品的μsec-mals分析。当一个样品出现明显的低摩尔质量峰时，两个样品的摩尔质量在色谱图上完全重叠，表明两个样品具有相同的构象。gydF4y2Ba

实验gydF4y2Ba

金融工具，如AcquitygydF4y2Ba^®gydF4y2BaUPLCgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba系统与APC 125和450 Angström孔隙SEC色谱柱(Waters Corp.， Milford, MA)， angydF4y2BaOptilab UT-rEX折射率探测器gydF4y2BaUHPLC (Wyatt Technology)和μDAWN MALS检测器(Wyatt Technology Corp.， Santa Barbara, CA)用于获取本研究中提供的数据，并使用Wyatt Technology的ASTRA进行分析gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba软件以4 ~ 20 μL的注射量、0.5 ~ 1.0 mL/min的流速为典型条件。更多的试验表明，任何给定物种的洗脱体积可能随流速而异;然而，在0.05 μL/min和2 mL/min的流速范围内，由光散射确定的摩尔大小和质量不受影响。gydF4y2Ba

表1。gydF4y2Ba两种环氧树脂的摩尔质量矩和多分散性值以及实验不确定度(精度)，每一种都有两个重复。后续运行之间的协议相当不错。gydF4y2Ba

	Mn (kDa)gydF4y2Ba	兆瓦(kDa)gydF4y2Ba	PD（MW / MN）gydF4y2Ba
EP1 (001)gydF4y2Ba	1.55±0.02gydF4y2Ba	3.26±0.01gydF4y2Ba	2.10±0.03gydF4y2Ba
EP1 (002)gydF4y2Ba	1.55±0.02gydF4y2Ba	3.25±0.01gydF4y2Ba	2.10±0.03gydF4y2Ba
EP2 (001)gydF4y2Ba	3.58±0.07gydF4y2Ba	7.90±0.02gydF4y2Ba	2.21±0.04gydF4y2Ba
EP2 (002)gydF4y2Ba	3.47±0.06gydF4y2Ba	7.96±0.02gydF4y2Ba	2.30±0.04gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

UHP-SEC为大分子的表征提供了许多优势，包括合成聚合物，其大小从数亿g/mol到数百万g/mol。然而，这些只能通过μDAWN在线光散射检测器实现摩尔大小和质量的绝对测定，从而解决尺寸排斥色谱在UHPLC环境下可能加剧的固有限制。gydF4y2BaUHP-SEC-MALSgydF4y2Ba能够表征没有参考标记物的复杂分子，如共聚物、长链或支链聚合物。因此，光散射是分析、工艺开发和QC实验室实施UHP-SEC的重要工具。gydF4y2Ba

参考gydF4y2Ba

1.P.J.怀亚特，分析化学学报272,1-40 (1993)gydF4y2Ba

2.有关光散射应用于大分子和尺寸排斥色谱的简要概述，请参阅gydF4y2Bahttp://www.wyatt.com/TheorygydF4y2Ba

3.V.H. Hsieh和P.J. Wyatt，《科学报告》7，文章编号:10030 (2017)gydF4y2Ba

4.s·m·罗兰和a·m·斯特里格尔，gydF4y2Ba分析化学gydF4y2Ba84gydF4y2Ba(11), 4812 - 4820 (2012)gydF4y2Ba

这些信息已经从Wyatt Technology提供的材料中获得、审查和改编。亚博网站下载gydF4y2Ba

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