有各种原因来衡量生物系统的光谱特征。彩色/本机细胞和组织吸收和释放光,留下清晰的光谱特征。光谱学是一个通用的工具,有助于检测和测量物质通过这种独特的指纹谱,并且可以被认为是一种“化学视野”。
肿瘤的发病和性质可以通过测量确定,例如,轻微变化的细胞学和组织学样本的光谱资料,甚至使用光纤探针在体内组织。视网膜疾病的状态也可以检查通过光谱检测。
成像技术
在荧光显微镜,几个荧光探针用于标签生活或固定的细胞。每个探测特定于某一细胞内的组件。挑战还来隔离不同的光谱重叠信号从这一系列的荧光标签创建一个精确的定量,和高对比度的浓度,细胞内的位置和交互组件被分析。
这是一个正当的挑战,因为在当代涉及多标记的方法重新定义后基因时代如何关键蛋白质功能、细胞生理机制,及相关疾病研究和解释。尽管拉曼光谱本质上是一个薄弱的现象,拉曼乐队拥有极窄带宽相比标准荧光带。
拉曼适用于光谱的多个物种歧视空间重叠,加上多元和反褶积分析时更强大。
光谱成像的感觉,量化的二维空间图像在第三个光谱维度创建一个“数据立方体”,最初支持在卫星成像和机载监视领域创建光谱数据描述测试区域的化学成分。
在这种配置中,输入信号的线可能会专注于一个成像光谱仪,由此产生的可怕地分散的光从这条线在哪里投在一个区域的成像CCD。在CCD操作在一个帧速率足够快,机载工艺和连接的扫描检测系统在地面和3 d数据迅速建立起来。这之后,数据立方体可以可视化两种原则的方式:
- 一组不同的单一波长的图像可以生产
- 从任何空间点在图像光谱可以派生
当光谱分散在许多光谱通道,称为多或hyper-spectral成像的方法。光谱成像技术的发展,监测等领域内已经持续了二十年,和大多数的数据可以用来解决生物产生挑战。
多光谱成像
荧光显微镜的领域内,特别是在活细胞,多光谱成像有助于获取完整和全面完整的动态数据标签样本。定量光谱“分离”算法可用于deconvolve每个图像点的光谱为它的组成发光物种和它们的相对贡献。
可以有效地应用于分离情况下有一个主要的几个染料的光谱重叠。这允许使用荧光蛋白质如GFP和最常见的突变,YFP, CFP和ds-RED荧光共振能量转移(FRET)和co-localization方法(图1)。
图1所示。荧光蛋白发射光谱重叠的示意图表示。通常广泛的自体荧光也显示。
烦恼是特别容易相当大的光谱“相声”。实现高效的烦恼,很大程度的重叠的吸收光谱之间应该存在受体和供体的发射光谱染料。
这种情况常常不可避免地伴随着重要的叠覆在两个发射光谱,一样的烦恼对GFP / YFP标准。
荧光共振能量转移
成功的烦恼可以由使用窄带滤波器和把幽灵似地离散图像上的两个摄像头或相邻字段视图里面相同的相机。相声的影响可以减少刺激受体和供体物种,然后分离从两个“基于过滤器渠道”。
通过这种技术,快速、并行成像的两个或三个荧光团。相声成为一个主要的问题在更大数量的荧光团的情况下处理,特别是当荧光团更可怕地重叠。
在这种情况下,需要更多的光谱通道有效地隔离信号。然而,而不是使用窄带滤波器分离信号从紧密重叠的荧光团,多光谱成像可以快速执行和整个未经过滤的发射光谱可以收集,其次是分离。
如果这样的配置,然后更好的信号噪声图像可以实现,因为它没有必要放弃大部分的排放光子通过窄带滤波器。任何自发荧光的样品可以通过光谱成像和不混溶分离和删除。
尽管这种类型的方法对多光谱图像分离提供了实实在在的利益,也存在许多技术挑战。几个关键属性会出现在理想的光谱成像系统。
这种类型的系统能够采集光谱数据建立数据立方体在快速的方式,允许动态的吞吐量和分析样本。光谱成像系统将充分敏感的最大探测器量子效率(量化宽松政策),最小的探测器噪声和高光学吞吐量产生一个高信号噪声(S / N),它已经表明,光谱分离的效果是相当大的在这种情况下。
需要足够的光谱分辨率,使有效的隔离成分造成的样本——所需的光谱通道数量是由
- 造成重叠的物种的数量
- 如果现有参考发射光谱可以用于分离还是“未知数”被记录下来
如上所述,不需要丢弃光子获得首选的光谱分辨率和分离如果整个重叠光谱的波长范围必须收集和阻止使用窄带滤波器的检测通道。这种方法导致更高的分辨率,更高的S / N,和更准确的量化。
EMCCD技术
从和或EMCCD技术可以集成到敏感的光谱成像装置。独特的S / N比这更大的由传统CCD相机功能提供快速读出速度。
EMCCD fast-readout成像设备,它产生的帧速率适合记录更快的数据立方体或动态烦恼的事件。
在所有活细胞的直接成像研究,优先保护生活主题尽可能减少损伤的光毒性的细胞/组织和photo-bleaching集成荧光团。因此,EMCCD探测技术的技术显著的好处。
EMCCD具有所需的速度和灵敏度捕捉高光谱解析和S / N的图像集弱发光物种和还允许激光激发功率的衰减。细胞光毒性和染料photo-bleaching大大减少通过最小化的激发力量。
与ccd光谱方法解决波长的传统方法,如光栅色散元素,这将把波长光在一维数组分开。专用光谱CCD专门为这种类型的格式是可用的应用程序——这种格式可能延长形状,标准像素格式是1600 x 200或1024 x 128。
在标准光谱读出模式,光线分布在水平维度提供> 1000“光谱通道”和纵列是封存在芯片,产生更大的光收集面积和加速获得光谱帧速率。
和或先进的iXon3 EMCCD相机功能成像传感器格式如1000 x 1000年或512年51。这些像素格式被设计用于在典型的光谱模式下,执行广泛的垂直沿垂直列装箱尺寸。
和或的NewtonEM EMCCD相机是一个新的专用光谱学EMCCD相机。这个USB 2.0, -90°C热电(TE)冷却平台有1600×128或1600 x 256像素格式,并已用于快速光线的光谱应用。
光谱成像摄谱仪
还有其他有效的方式阅读EMCCDs光谱方法,例如,一个成像光谱仪等和或三叶草303我可以被使用,这将提供空间分辨率以及入射狭缝的尺寸。可以读出EMCCD作为绝对的形象,与沿垂直空间和光谱分辨率水平轴垂直于这个维度。
图2显示了一个光谱色散线照明。此外,传感器可以在几个水平跟踪数组,software-configurable位置和大小,与每一个产生一个光谱,例如,输入对应的光纤在示例。
图2。光谱色散线照明
两个选项是可用的,如果异常快速光谱率已经达到,但对于每个选项光只能分散在传感器上的限制行数没有任何光落在其余的活跃区域。宣读“快速动力学模式”的成像EMCCD有助于获得最快的时间分辨率(图3)。
图3。快速动力学读出
在这个配置中,频谱分布在几行上方的传感器。下面的“暗行”然后用来存储光谱,从暴露面积。这个过程一直持续到整个传感器了。
整个地区正常读出,多个光谱处理软件。可以实现时间分辨率的时间由一个步骤,这些行向下移动的和或iXonEM + EMCCD可以调整范围< 1µs /行,与1999存储行。
如果实验需要快速光谱时间分辨率,但不能通过传感器的存储大小有限,那么EMCCD可以读出“裁剪传感器”模式(图4)。在这种模式下,传感器可以误以为它比实际要小,并且可以读出不断在相对更快的帧速率。
光谱时间分辨率由时间读出传感器控制较小的定义部分。例如,通过将分散到10 x 1000区域的底部iXonEM + DU885-K 35岁MHz像素读出,可以读出在成千上万的光谱/秒。一些新的光谱成像方法已经被应用,利用超灵敏和快速读出EMCCDs的属性。
图4。裁剪传感器模式
多光谱共焦扫描
新一代多光谱共焦扫描是一个区域,正在解决。虽然几个商业系统可用于多光谱共焦扫描显微镜,有些是已知的主要缺点。
特别值得一提的是一些格式。在一个配置中,一个光栅用于分散共焦扫描信号从指标的点在32的线性阵列光电倍增管(pmt)。这主要遭受pmt的低量化宽松政策,特别是对红色,相邻通道的不同反应。在另一个商业模式,一个PMT是用于检测和光栅tilt-scanned整个光谱范围在激光点图像上的停留时间。
很容易相信大量的时间是参与进行光谱扫描250000 > 512 x 512像素的图像。同时,这种类型的配置不适合光谱分析的动态系统同时面临的不利影响广泛的照明的样本。
要解决这些问题,EMCCDs系统可以实现多光谱共焦扫描。这种方法提高了利用单光子的量子效率> 90%敏感性,在黑色背景的传感器,像素读出速度快和数组结构。
激光的停留时间应设置为对应时间暴露和读出的短行32像素,这足以使成功分离的几个已知发光染料,从而导致了数据立方体的512 x 512 x 32只需要不到1秒。
甚至更少的光谱通道,可以预期更快的速度。EMCCD像素提供一个独特的敏感性而不是PMT-technology受益,这是红色和大约5倍到十倍的蓝绿色。多光谱成像显微镜也可以由使用模块,包括递送的色散光栅,例如,检查员。
在这些系统中,检测和色散的光学原理有点类似于前面提到的机载监视。这个系统被放置EMCCD和显微镜,和光收集从一个方向照亮线样品,与线来自激光或过滤灯照明。
从线是收集的光分布在EMCCD数组甚至现有的一部分地区更快的帧速率较低的分辨率和光谱范围(图5)。跨EMCCD的像素列提供决议在λ,和y方向上扫描通过机动阶段逐步将样本。
对于每个阶段步骤,照亮数组应该接触的面积和读出。EMCCDs的敏感性能是适合这种方法,允许更快的读出性能以及较短的曝光时间。
图5。线扫描光谱成像
结论
EMCCD的性能很容易用于加速光谱成像方法,在液晶可协调的发射滤波器用于先后获得λ-stack图像光谱范围,涉及到整个区域的照明和成像,wavelength-at-a-time。
这种方法经常遭受收购的速度限制,但大大增加了EMCCD的读出速度和灵敏度效益呈现技术。可协调的波长励磁电源也可以扫描激发光谱成像,检查接下来的排放强度。光谱分离算法可以很容易应用到以这种方式获得的数据。
这些信息已经采购,审核并改编自和或提供的材料科技有限公司亚博网站下载
在这个来源的更多信息,请访问和或科技有限公司