作为胶体和热稳定性指标的扩散相互作用参数(Kd)

对于治疗性生物分子稳定性是一种关键质量属性，对于建立药物状性能和适用性来说是一种重要的质量属性。然而，建立候选分子或配方的稳定性，这既有时间密集和费力。

生物制剂的开发人员正在寻找高通量筛选技术，可以测试和排序不同的候选组合、缓冲条件和赋形剂，以减少与长期稳定性研究相关的时间、精力和成本。

这些屏幕中使用的实验方法需要识别各种稳定性指示参数（啜饮），因为没有单个参数尚未显示为银弹，这表明在暴露于一系列环境压力（例如冻结）时的长期保质期或稳定性-Thaw或升高的温度。

短期聚集，热稳定性和胶体稳定性是迄今为止最有用的啜饮。短期聚集代表小聚集体的形成，热稳定性是蛋白质的倾向聚集和/或展开温度，通常是因为疏水芯的暴露。

胶体稳定性是由于疏水表面残基、表面电荷和类似基团的弱吸引力而使分子结合的倾向。这些sip并非完全相互独立。

例如，胶体稳定性通常与可逆关联有关，但是在自吸引条件下增强的接近能够促进不可逆聚集速率。然而，增加的表面电荷可以提高胶体稳定性并减少胶体吸引力，但是降低热稳定性，因为蛋白质的三级结构通过电荷稳定。

已经使用各种方法来评估啜饮，例如静态光散射，红外或拉曼光谱，圆形二色性，内在和外在荧光，以及差示扫描量热法。然而，动态光散射由于其能够为与稳定性相关的各种现象提供定量洞察，这是一种多功能技术。

它可以同时量化聚集和分布的骨料大小和热稳定性通过区分纯展开和聚集通过温度转变。胶体稳定性可以通过扩散的浓度依赖性来测定。比体积和平均摩尔质量的变化可以通过分析相同的数据来确定。

生物分子的稳定性不是完全的内在性质，因为它受蛋白质被配制和缓冲组合物的浓度的影响。必须以特定的离子型，离子强度，pH和赋形剂曲线的函数测量蛋白质稳定性，用于最佳和成功的制剂。

幸运的是，使用行业标准的Microwell板，DLS兼容每小时数百条条件的高通量，低量筛选数百条件。Wyatt Technology的Dynapro读卡器可采用动态光散射(HTS-DLS)进行高通量筛选。

它包含96,384或1536孔板，并在4 - 85°C的温度范围内同时对所有样品进行温度扫描。可以将HTS-DLS提供的多路方法扩展到其他各种配方条件，以快速表征蛋白质行为。

图1。DynaPro平板阅读器能够进行高通量DLS聚合和稳定性指示参数的研究，提高配方研究的生产率。

热和胶体稳定性的同时测量提供定性独特的数据：胶体和热稳定机构之间的直接相互作用，由热转换附近的胶体相互作用参数的温度依赖性表示。

本文讨论了HTS-DLS测量那这揭示了热诱导蛋白在胶体相互作用上展开的影响，并提供了迅速等级蛋白质制剂的定量度量。

交互参数

由于布朗运动，DLS可以直接测量散射强度的波动，并研究了测量平移扩散系数d_T.以及有效的分子大小，流体动力半径r_H．

DLS也可以获得粗略的尺寸分布，以评估单体和聚集体的群体。虽然与分离方法不如分离方法，但诸如偶数排除色谱耦合到光散射检测器（秒筒），但DLS通常足以用于筛选目的，甚至甚至会揭示大小在半径中占3-5倍的大小群体的存在。

D._T.由于基于带电和疏水残留物的非特异性蛋白质 - 蛋白质相互作用，是浓度（c）的函数。分析D._T.与C导致一阶扩散相互作用参数k_D.如下式所示。

D = D_0.（1+ K._D.C + ...）

K的正值_D.代表排斥分子间相互作用，负值代表吸引力。扩散相互作用参数和第二病毒系数a之间存在直接关系₂，常见的热力学测量胶体稳定性和聚集趋势。

测量A.₂较低，高吞吐量通常非常困难和k_D.充当方便的代理。因此，可以使用k_D.用于快速比较不同的蛋白质配方和选择或工程更稳定的生物分子。

亚博网站下载材料和方法

dynapo平板阅读器进行了高温- dls测量，用于同时进行热、胶体和混合稳定性分析，还评估了聚集的程度和尺寸分布。该仪器的一个关键优点是能够在井中原位完全测量样品。

这种能力消除了对微流体平台共同的随身携带问题，同时提高了吞吐量。通过溶解单克隆抗体（mAb）制备储备溶液₁）在50mM的BIS-TRIS-丙烷缓冲液（BTP），pH值为6.5,7.5,8.5和9.5至最终浓度为15mg / mL。

下一步是将原液过滤到0.1µm，稀释并将其排列在384孔微滴度板(Aurora)中，4个pH值分别对应6个不同的蛋白浓度(0.47 - 15 mg/mL)，共5个重复。每孔装20µL溶液。

400 g离心1分钟，每孔用1-2滴石蜡油盖上，防止蒸发。在测量前，以400 g离心1分钟。

使用同一板中的牛血清白蛋白和溶菌酶的对照样品在25℃下进行初始测量。然后将延长的测量序列作为温度的函数进行，以0.1℃/ min的速率从25℃逐渐增加至85℃。

mab.₁在斜坡期间依次测量溶液，在每种浓度下完成五次2秒的采集，每0.5℃，每浓度为3孔的pH值，每0.5℃。动力学软件E.来自Wyatt技术和Microsoft Excel用于执行仪器控制，数据采集和分析。

进行自相关分析以确定D._T.和R._H和K._D.来自D的线性回归_T.vs. c。r的情节_H与温度的关系适合于一个合适的模型来确定聚集起始温度T_发病．

结果与讨论

作为pH的函数的交互参数

mab.₁抗体D降低_T.(或增加R_H作为浓度的函数(图2)，它匹配一个负k_D.和相应的蛋白质蛋白质吸引力。这款mab.₁显示k_D.<0对于测试的所有pH值（图3），表明组装成低聚物种的趋势。

图2。测量的水动力半径作为三种蛋白质的浓度和pH的函数。

图3。交互参数，k_D.，作为三种蛋白质的pH的函数。

热诱导的聚集

除了55°C左右的热转变，MAb₁抗体在pH 8.5时迅速聚集成大的复合物，与R_H在75°C，跨越80和800 nm(图4)_发病用浓度降低，跨越55.0至56.8°C（图4，插图）。

图4。在pH为8.5时，流体力学半径作为温度和浓度的函数。在>56°C的温度下，可以明显地形成高阶团聚体。

聚集的最终状态在很大程度上取决于浓度，在最高和最低浓度之间的平均粒子的平均尺寸中的平均尺寸不同。yabo214在70 - 75°C下，发生第二转变，可能与另一个IgG域的展开相关联。

这导致大规模的聚集成测量大于1μm的颗粒。这种高水平的聚集表明观察到超过热转变的浓度依赖性主yabo214要是由于较高的分子冲突速率。

这可以通过改变温度升温速率来验证。但是，在pH9.5，mAb₁抗体与R_H=〜4.8nm，IgG的特性，基于浓度为15至22nm的稳定值，对于超过62°C的温度（图5）。

图5。pH为9.5时，各抗体浓度的流体力学半径与温度呈s型关系，中点随浓度变化不大。

通过该pH的聚集体的稳定性和微小尺寸表示可逆的低聚，并且可以通过改变斜坡速率或反转温度斜坡或两者的组合来验证该稳定性和微小尺寸。在大约75℃下，抗体出现进入次级展开过渡，类似于pH8.5，尽管具有相对较小的聚集量，但在较低浓度下没有重大影响。

在两个条件下的聚合过程中观察到的定性变化另外在使用DLS正则化分析中获取的大小分布中解释。在80℃和浓度为1.88mg / ml的温度下，pH 8.5样品显示具有30至100nm和300至3000nm的群体的双峰分布，而pH 9.5样品在相同水平的浓度显示只有80至300nm的一个分布（图6）。

图6。尺寸分布在80°C通过正则化获得。左:pH值8.5;右:pH值9.5。

通过热转变的相互作用参数

K._D.低于热转换的负面，并且对于两组pH值的温度粗略恒定。在pH 8.5，k的程度_D.是pH 9.5的2倍，说明分子间吸引力更强，这与极其不同的聚集行为相对应。

K._D.显示对pH的清晰过渡行为，接近折叠展开过渡并朝向聚合的开始。

K._D.在pH值8.5时，经历了从53°C到59°C的主要步骤变化(图7和插图)。有趣的是，这种变化在发生任何实质性聚集之前的几度就开始了，这表明纯展开的结果增加了蛋白质对蛋白质的吸引力。

图7。在最低浓度下，扩散相互作用参数（符号，左轴）和半径（实线，右倒轴）作为pH8.5的温度的函数。插图:同样，突出显示过渡区域。

K._D.恒定超过59°C，尽管由于在存在双峰群时分配平均半径的数值复杂性而嘈杂。聚集程度基于浓度，如图4所示。

然而，这似乎指出了更高的碰撞率。因此，量化值k_D.进一步比〜56°C可以提出聚集过程的动力学和历史，而不是实际的热力学相互作用。

pH值为9.5时，k发生类似的变化_D.表示展开转变:聚合前，k_D.变得更具吸引力（或负面），而不是逐步改变，就像量化的流体动力半径开始指示聚合一样，局部最小值发生（图8）。

k的程度_D.在这一聚合后减少了减少负面。这是k的这种变化_D.这表明，随着疏水核心的暴露，吸引作用在初始展开转变期间增加。

图8。在pH值为9.5时，最低浓度下扩散相互作用参数(符号，左轴)和半径(实线，右反轴)随温度的变化关系。插图:同样，突出显示过渡区域。

相反，一旦在这种情况下获得稳定的结构，相互作用将部分地减少，因为暴露的区域被溶液隐藏起来。在75°C左右，在k中明显看出次要展开过渡_D.．

结论

通过在早期开发阶段进行蛋白质制剂，研究人员可以专注于最可行的候选者，并节省大量的时间和精力，样品和测试设备。本研究表明，Dynapro读数器如何使用如何在筛选过程中同时确定蛋白质的胶体和热稳定性和真正的聚集状态，以对制剂条件和候选分子的有效性进行排名。

胶体稳定性和热稳定性被测量为k_D.和T_发病,分别。k的温度依赖性_D.提供了改进对展开过程对胶体相互作用的影响的理解，因为该方法显示出从蛋白质和缓冲液隐藏的部分。

DLS可以提出化学稳定性;溶液中的特异性体积和平均摩尔质量作为温度的函数;和溶液粘度，这是高浓度的生物治疗剂的发展中的另一个主要方面。

HTS-DLS提供了大量数据，用于快速筛选缓冲条件，候选分子和赋形剂，以更高的生产率。

此信息已采购，从Wyatt技术提供的材料进行审核和调整。亚博网站下载

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