利用自动核磁共振识别和定量植物提取物

植物提取物的价值在于从其天然化合物中获得的可感知的益处。这些提取物是个人护理产品和保健品的主要成分。消费者希望采用更健康的生活方式，这推动了这些行业的发展，并继续蓬勃发展——预计到2017年，单是营养药品一项就将达到2049亿美元。有益的说法往往依赖于提取物的某些化合物，这就对确保提取物的身份和纯度提出了巨大的要求。

核磁共振波谱法可用于这些任务，因为该方法具有自动化和高重现性。植物提取物是复杂的混合物，通过提取工艺制备，以提高优选成分的数量，被认为是负责所需的好处。

关键成分的数量和不需要的物质(残留溶剂、掺杂物和不相关的植物物质)的缺乏反映了植物提取物的质量。亚博网站下载核磁共振波谱可以检测和测量植物提取物和其他复杂混合物中的成分。它还提供了一种快速和高重复性的方法来验证植物提取物的纯度、鉴别、成分和强度，提供质量控制分析和产品评估。在同一光谱中可以检测不同类型的化合物。

1D^1.H光谱通常需要不到10分钟的时间进行数据采集和分析。本文讨论的程序和能力，以自动化的核磁共振分析金丝草提取物用于植物鉴定。评估组件的特性和数量以进行质量控制。

早些时候，LC-UV方法被用于测量goldenseal中的hydrastine、canadine和小檗碱，但这些方法未能提供有关该化合物的高度特异性信息。相比之下，核磁共振是一种全自动、信息丰富、快速的评估工具，可以提高产品成分的可信度。

金海豹:一种重要的植物学

金海豹是美国东部和加拿大东南部的一种本地植物，由于其抗菌、药理、免疫刺激剂、抗癌和抗菌特性，它一直被用于传统医学。这种植物现在被认为是20种最受欢迎的草药补充剂之一，并在全球范围内使用。在美国，金海豹紫锥菊组合是15种最畅销的植物性膳食补充剂之一，2008年的销售额约为700万美元。

金海豹的药理作用主要归功于植物中的生物碱、水合碱和小檗碱。由于金海豹的受欢迎程度和生长缓慢的特性，许多其他含有小檗碱的植物取代了这种植物。掺假的成分包括俄勒冈葡萄根、黄根、黄连和小檗。大多数掺假物质中都含有小檗碱，然而加那定和联氨碱只在金海豹中发现。

亚博网站下载材料和方法

材料标识

从2005年到2006年，渥太华大学的约翰·阿纳松博士从形态学上鉴定出了金海豹的根。

白毛茛提取

2005年5月，从汉密尔顿（加拿大安大略省）goldenseal农场获得干燥的goldenseal根，随后研磨成粒径小于250µm的粉末，用旋转搅拌桶均质，最后在-80°C下储存。使用超声波浴，在35°C下提取约200 mg材料样品20分钟。

提取优化

对金海豹根粉中三种关键生物碱的最高回收率进行了评估(图1)。在90%甲醇/水/0.1%甲酸(v/v/v)溶剂体系中，主要生物碱的回收率最高可达97%以上。超声20分钟，提取6次。

混合提取液后，对其进行过滤。获得的上清液在室温下用高速真空干燥，并利用该黄连草根粉末干提取物的NMR来检测和定量主要代谢物，这些代谢物被认为存在于黄连草根中，包括肼丁、卡纳丁和小檗碱。作为小檗碱、卡纳丁和肼斯汀的参考标准，使用了NRC认证标准物质，分别命名为Berb-1；卡纳一号和海德拉斯一号。

图1。小檗碱(A)、水合碱(B)和加拿大定(C)的分子结构。

核磁共振的条件

样品溶解在600 ul DMSO-d中_6.，旋转1分钟，超声5分钟，再旋转1分钟，最后以13200 rpm离心。将上清液转移到一个5mm的核磁共振管中。提取液、水合碱、小檗碱和加拿大定的物质质量分别为16.4 mg、12.3 mg、11.5 mg和10.8 mg。在400mhz和600mhz时，通过Bruker Avance III谱仪记录NMR谱^1.H noesyigld1d脉冲序列。在8分钟内获得每个样品的光谱（32次扫描），并使用Bruker的AssureRMS 1.5 pl2软件包自动执行NMR分析。该软件包使用PULCON方程和外部量化标准获得绝对量化结果。

核磁共振谱数据库的生成

利用该方法建立了光谱数据库(SBASE)^1.氢化碱、卡那定和小檗碱的核磁共振谱。该SBASE作为金海豹主要代谢物自动检测的化学位移参考库。使用Assure-RMS程序，通过消除溶剂、噪声和杂质峰以及广泛的可交换信号来生成SBASE条目^1.H NMR谱图(图2)。

图2。生成光谱数据库(SBASE)条目的示例。^1.H NMR谱图(上)和DSS后的SBASE条目(下)，DMSO- D_6.H_2.O，广泛的交换信号和噪音被删除。

所得的单个化合物的SBASE条目包含了偶联、峰形状、峰位置和峰强度数据。水合碱、小檗碱、DSS (NMR参比标准)和DMSO(溶剂)SBASE条目与金海豹提取物的对比如图3所示。

图3。400兆赫黄金赛尔^1.H NMR光谱（黑色）与小檗碱（蓝色）、肼斯汀（红色）、二甲基亚砜（紫色）和DSS（绿松石色）的SBASE条目相比较。黄连素在金黄色光谱中的信噪比为547，信号为7.82 ppm（单质子），频率为400 MHz。对于hydrastine，质子在7.37 ppm（单质子）下的S/N为173。

当比较耦合、强度和峰移时，可以在提取光谱中立即检测到两种目标化合物——水合碱和小檗碱。比较了goldenseal和canadine SBASE条目，也检测到了它(图4)。

图4。芳香族(左)和甲氧基(右)区域的展开^1.与加拿大(红色)的SBASE条目相比，金海豹在600兆赫(黑色)和400兆赫(蓝色)的核磁共振氢谱。在3.85 ppm时，甲氧基信号(3个当量质子)的信噪比在400 MHz为494,600 MHz为891。观察到峰值位置有轻微的变化。

关键部件的检测与量化

从粗提物光谱中考虑三种主要成分的信噪比（S/N），以找出goldenseal自动分析的经验条件。在400 MHz下，一个8分钟（32次扫描）的实验提供了关于卡纳丁的足够S/N，它恰好是所考虑的三种成分中的最低浓度（图4）。根据3.85 ppm下分离的甲氧基信号测定的S/N在400 MHz和600 MHz下分别为494和891。在400 MHz下检测低浓度成分需要延长实验时间。假设NMR的S/N增加了2的平方根，则可以根据组分的预期浓度测量所需的扫描次数。

使用Assure-RMS程序建立自动化分析方法(图5)。通过从SBASE条目中选择所有组件，自动导入SBASE组件(图5A)。最终填充了一个搜索列表，其中输入了组件的类型。此外，可以设置最高和最低浓度，以满足特定的产品规格。该程序使用这个表和SBASE数据填充NMR谱中的搜索区域，以便进行自动评估。然后，根据其他重叠或附近的信号，评估用于量化的峰值的测量能力。随后，将Assure-RMS方法保存并用于金海豹提取物的自动分析和报告。

图5。用于生成金海豹自动分析方法的Assure-RMS程序包括:(A)从SBASE进口的成分，(B)分配的成分类型(主要成分、溶剂、核磁共振参考、可能掺杂的成分等)，允许的最低和最高浓度和定量报告标准(mmol/L)，(C)识别被选择用于量化的峰(红色)，这些峰通常是很好分辨或容易识别的信号。

结果

对金海豹提取物的自动分析有助于检测三种主要成分的存在，随后报告了定量结果，如表1所示。

表1。金海豹中组件的自动量化结果提取样品在400mhz采集的数据。仅用于身份匹配的条目。未测定DSS和DMSO的浓度

科莫镑	类别	浓度（mg/g）	标准偏差
小檗碱	主要成分	75.77	1.90
黄连碱	主要成分	54.14	0．82
Canadine	主要成分	7.07	5.17
DSS	核磁共振参考	NA	NA
二甲基亚砜	溶剂	NA	NA

在3种关键成分中，小檗碱含量最高，其次是水合碱和加拿大定，分别为75.8 mg/g、54.1 mg/g和7.1 mg/g。所得结果与金海豹提取光谱的物理分析结果一致。

结论

核磁共振(NMR)可以精确地检测从金海豹根粉末粗样品中提取的canadine, hydrastine，和小檗碱的存在和数量，而不需要额外的纯化和分离过程。在自动化分析中，我们生成并使用了一个核磁共振光谱数据库，该数据库还可以扩展到搜索更多的金海豹成分。这种自动化过程提供了一种有效的方法来检测提取物的成分，但也可以应用于其他复杂混合物的成分验证，以进行产品的评价和质量控制。

这些信息来源于Bruker BioSpin - NMR、EPR和Imaging提供的材料。亚博网站下载

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