用等温滴定量热法分析脱胶数据

表面活性剂，如洗涤剂，是生物化学和工业应用中不可缺少的化合物。它们在纯化、提取和处理膜蛋白等过程中是必不可少的。洗涤剂本质上是两亲性的，这意味着它们提供一种膜样的环境。完整膜蛋白在水溶液中需要一个膜样环境来保持其固有的功能和结构。

重要的是确定哪一种洗涤剂适合于稳定、溶解和重建优选的蛋白质，以及其结构、生化和生物物理分析。

因此，筛选不同类型的洗涤剂是必要的。对于每一种工艺，其适宜性取决于所研究的膜蛋白，而这种选择取决于一些物理化学性质，如极性、链长、头基电荷或头基大小。相反，被认为是膜蛋白分离的最佳洗涤剂可能不是最佳选择在体外分析和下游净化。

SDS是一种苛刻的洗涤剂，可以使蛋白质变性，使其失活;离子洗涤剂不能用于离子交换色谱或等电聚焦;triton - x100洗涤剂吸收紫外线范围和阻碍光谱研究。虽然透析通常用于去除洗涤剂以实现蛋白质重组，但低临界胶束浓度(CMC)的洗涤剂需要很长的分析时间。

表面活性剂的一个基本性质是CMC，即临界胶束浓度。当表面活性剂在水溶液中的浓度超过CMC时，它们会形成胶束或胶态聚集体。在这个浓度或浓度附近，可以看到不同物理性质的变化。

当这些变化发生时，可以通过一系列的技术，如核磁共振波谱、电导率和表面张力测量以及染料结合实验来实验建立洗涤剂。

然而,等温滴定量热法（ITC）是一种合适的技术，可以准确测定CMC。该方法具有高重现性、极好的灵敏度和无与伦比的分辨率。它还消除了样品标记的需要，并给出了一个全面的热力学轮廓的实验，包括摩尔熵和焓的变化，伴随胶束化。

因此，ITC法常被用于测定不同类型的表面活性剂的cmc，如胆盐、烷基酚乙氧基盐、tritons和烷基吡啶卤化物等。ITC法还测定了嵌段共聚物、氟表面活性剂、蛋白质、表面活性肽等的cmc。

当使用ITC来获取表面活性剂和CMC的脱胶热时，通常采用两种数据分析策略。在第一种方法中，测量了脱胶热的初始导数与表面活性剂浓度，在第二种方法中，脱胶等温线应用了一般的s形拟合。

本文将展示如何有效地集成这两种策略，从而提供一种数据分析方法，在不存在任何用户偏见的情况下，提供出色的再现性。

胶束形成模型

当ITC技术用于CMC分析时，将表面活性剂在溶剂（如水或缓冲液）中的悬浮液滴定到不含表面活性剂的同一溶剂中。添加的悬浮液中表面活性剂的浓度远远大于CMC。

下列范围定义了这种脱胶滴定的等温线:

• 当表面活性剂浓度小于CMC时，胶束分解成单体
• 当表面活性剂浓度接近CMC附近的过渡点时，首先出现胶束
• 当添加更多胶束表面活性剂时，胶束在几乎恒定的单体浓度下稀释

在ITC实验中，所确定的脱胶过程与胶束形成过程相反，这可以用不同类型的热力学模型来解释。在标准模型下，假设整个过程中只存在胶束和洗涤剂单体，类似于图1A和图1B所示的伪相分离和闭合关联模型。

此外，模型还可以考虑中间聚集数的洗涤剂组装的种群，类似于图1C和图1D所示的等键聚集模型和合作聚集模型。

图1。胶束形成的热力学模型。(A)伪相分离模型。(B)闭合关联模型。(C)等链模型。(D)协同聚合模型。

反胶束等温分析基于伪相分离模型，该模型假设胶束和单体是相互平衡的分离伪相。伪相分离模型对胶束的结构和大小没有任何精确的假设，而封闭缔合模型对胶束的大小有具体的假设。这里，胶束化也被认为是一种化学计量缔合反应。

当洗涤剂浓度接近CMC时，假相分离和封闭缔合模型预测了样品的物理化学性质的快速变化。这种情况发生在标准聚合数大于50时。

相比之下，合作聚集和等轴模型能更好地再现稳定的变化。前者假设二聚体的形成比以下缔合步骤相对复杂，而后者则假设形成逐步聚合，每一步缔合步骤都由相同的缔合常数定义。

虽然这两种模型比赝相分离模型和闭合缔合模型更实用，但它们需要更多的拟合参数，因此在研究脱细胞数据或实验胶束化时不稳定。伪相分离模型更为可靠，因此可用于研究从ITC获得的脱细胞等温线。

脱胶等温线的简便数据分析

在大多数表面活性剂中，结合脱胶热图得到一个s形等温线。等温线的转变范围是由所记录的热量的突然减少来定义的。等温线产生CMC和Qdemic，这是脱胶热，使用以下方法:

• 在相变范围内，表面活性剂浓度的初始等温导数的极值为CMC。Qdemic是由在CMC的线性过渡前和过渡后基线之间的热量变化得出的
• 等温线采用通用的S形函数拟合，通过非线性最小二乘拟合得到Qdemic和CMC。

这两种方法可以结合起来，得到简单、无偏的脱细胞等温线检查。在第一步中，计算说明等温线的参数，在第二步中，将这些计算用作非线性最小二乘拟合到脱细胞等温线的初始值。根据下面给出的等式，这是由于一个公共的S形函数实现的：

式中，Q为标准反应热，c_D为量热池中表面活性剂的浓度。

图2。提供用于分析ITC脱细胞等温线的Excel表格。加载等温线数据并由用户提供注射器中表面活性剂的总浓度后（1），立即显示所有拟合参数的估计值（2）。非线性最小二乘拟合（3）后，拟合参数可用（4），并可通过置信区间（5）评估精度。其他复选框提供了文本（0）中指定的更多选项。只能修改橙色单元格的值。

在图2中，更多的复选框提供了文本(0)中给出的更多选择。应该只对橙色单元格的值进行更改。使用Microsoft Excel工作表进行脱胶等温分析应遵循以下步骤:

• 非单元化信息应以标准化形式加载到工作表中。
• 一旦数据加载，参数的近似值就会很快确定。
• 应该检查蓝框中的估价值，以及它们在图中的图形表示。在这个阶段,如果估计是无关紧要的,用户应该进入自己的估计在红盒子和随后的细胞必须确保复选框为随后的参数是不拒绝它作为不一致的参数从适合进行以下步骤。
• 应通过点击“拟合”按钮对数据进行非线性最小二乘拟合。
• 应该检查红框中随后显示的最佳拟合值以及图中的拟合值。如果某一特定值与数据拟合不一致，则应更改后续参数并进行检查，使其保持不变，并重复拟合。
• 通过在“置信区间”按钮上方的下拉菜单中选择首选参数并单击后者，可以评估最佳拟合值的拟合精度。置信区间估计的结果更新“置信区间”表。然后必须重复其他参数的置信区间。如果需要维护参数结果，可以单击“置信区间”表上给出的“保留CI表”按钮。

案例研究:CMC测定DM和CHAPSO

为了证明该方法，对两性离子洗涤剂3（[3-胆酰胺丙基]二甲氨基）-2-羟基-1-丙磺酸酯（CHAPSO）和非离子洗涤剂n-癸基-βD麦芽糖苷（DM）进行了脱细胞实验。

使用VP-ITC仪器进行滴定，过滤时间为2秒，搅拌器速度为310 rpm。在DM脱细胞的情况下，将约24 mM的洗涤剂滴定到电阻率为18 MΩ的三重蒸馏水中。实验在25°C温度下进行，参考功率为63µJ/秒，间隔300秒，进样量为10µL。在CHAPSO脱细胞的情况下，在pH值为7.0的20 mM磷酸钠缓冲液中滴定约120 mM的洗涤剂。

实验温度为35℃，参考功率为13µJ / s，间隔为750秒，进样体积为5µL。采用NITPIC进行基线分配，并通过奇异值分解结合热图峰进行数据分析。

在样品制备过程中采取了一些措施，以获得准确的脱胶滴定结果。使用前，水经过过滤，细胞内和注射器内的样品都经过过滤。

洗涤剂和吸湿化合物都被允许平衡到室温，然后在一个高度精确的微天平上称重，以防止库存浓度的误差。泡沫可以通过低速离心去除。如果洗涤剂的量是足够的，那么可以使用带有VP-ITC的ITC系统来实现更高的信噪比。

图3。在ITC监测下DM和CHAPSO的脱胶反应的代表性分析。(A,B)等温线描绘的积分反应热，Q，与滴定剂浓度和(C,D)可调参数ΔH°mic和CMC的置信区间是(A,C) DM和(B,D) CHAPSO的脱胶。(A, B)实验数据(黑色实心圆圈),通用的s形适合根据情商。(1)(红色圆圈),达到和post-transition基线的初始估计,(分别为虚线和冲蓝色和红色线),在中央军委Qdemic来源于最初估计和适应(分别为蓝色和红色实线),以及估计的过渡区域边界(垂直的蓝色虚线)。(C, D)。

如图3A所示，在测试DM去细胞化后，获得了与最终最佳拟合值相似的初始估计值。这是因为在显示良好信噪比的实验数据中使用了足够数量的注入。这导致优选拟合参数的置信区间变窄，如图3C所示。

然而，CHAPSO的脱胶导致了一个相对复杂的等温线。由于初始温度的急剧增加，过渡前基线坡度(m1)被高估了。

结果，得到不切实际的参数值。解决这个问题的一种方法是将m1和m2固定为零，并重复匹配。如果没有找到合适的值，可以使用估计，这些可以通过检查“使用估计作为固定参数的值”选项获得。图3B显示了这种方法的结果。

DM数据集的置信区间不对称且较宽，但仍然较窄（图3D）。因此，在最具挑战性的情况下，用户干预保持在最低限度，并对其进行可靠的分析国贸中心可以得到脱胶数据。解决方案也很容易确定。对于额外的分析，可以通过取消“使用估计作为固定参数的值”选项来使用永久值。

结论

本文展示了两步法如何在没有用户输入的情况下快速提供ΔH°麦克风和CMC。这种方法简单地使用表面活性剂浓度和注射器中的标准化和组合等温线。

对脱胶数据的分析被改编为Microsoft Excel电子表格，这有助于评估关于置信区间的拟合。在此分析策略的帮助下，ΔH°mic和CMC都有效地从脱胶等温线中提取，从而获得了快速、准确和可重复性的结果。

本信息来源、审查和改编自Malvern Panalytical提供的材料。亚博网站下载

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