表面等离子体共振和生物层干涉法筛选研究中的蛋白质质量控​​制研究

可以通过多功能和常用方法（例如表面等离子体共振（SPR）和生物层干涉法（BLI）进行高通量筛选和鉴定候选生物治疗剂。高通量SPR涉及将分子识别为固定在芯片上的关键靶标。但是，BLI允许将靶标或候选物固定在光纤探针上，然后将其浸入带有相对分子溶液的微孔中。结果，可以从筛选中选择一个或多个具有有益特性的候选治疗分子，例如快速结合动力学和高亲和力。

Testing of Candidate Biotherapeutics

可以在典型的屏幕中测试数十种至数百种候选生物治疗药。因此，在将它们注入微流体通道之前，设计了几种高通量SPR仪器，以从标准的微孔板上绘制样品。允许分析物通过与目标表位的特定关联在芯片表面上存在良好的候选物上的固定目标分子。BLI还涉及类似的过程，但不涉及微流体。然后产生一个信号，与通过光学探针的表面结合质量增加成正比。关于多个分析物浓度的这些信号的分析提供了亲和力和动力学。

样本质量是阻碍有效候选者选择的参数之一。通过在SPR和BLI筛选中使用的分子的纯度和溶液特性对测量结果严重影响。这些是：1）数据质量，以及2）微流体完整性。

但是，有一个多功能工具可以轻松解决样本质量分析。蛋白质质量是通过Wyatt Dynapro读取器II（图1）的高通量动态光散射（HT-DLS）测量的，而不会干扰溶液。测量值是在高吞吐量发现筛选平台使用的同一微区板上进行的。另外，DLS还可以确定分析物的扩散系数。

图1。Dynapro读取器II评估标准96、384或1536井板的溶液质量，而不会扰动样品。

分析物质量的意义I：杂质

通常被忽略的分析物质量是一个关键参数，有助于实现精确的测量，从而选择了适当的治疗候选者，从而提供了准确的结果。低分子量杂质（包括萃取物和浸润物）通常对SPR和BLI测量的影响很小。但是，像聚集体和外国颗粒这样的大杂质可以通过两种技术影响测量。yabo214

当粒子从芯片或纤维探针的表面距离几百纳米时，与纳米颗粒或骨料的质量成正比的信号尖峰会成立。

在低质量样品中存在大量较小的纳米颗粒和聚集体的情况下，产生了稳定的小信号波动，从而导致光学响应降解。yabo214图2显示了两种效果的模拟传感器图。

图2。在存在聚合分析物（模拟）的情况下获得的传感器。

分析物骨料可能会或可能不活跃。如果活性聚集体的数量相当大（例如，总分析物蛋白质质量> 5％），它们与固定的配体结合并产生SPR或BLI信号，该信号大于预期的单体相互作用。

对于非活性分析物聚集体，有效浓度将低于测量的总浓度，从而导致结合减少，并且亲和力明显降低。无论哪种方式，聚集体都可以导致候选结合特性的不当定量（图3）。

图3。聚集物可能会以多种方式影响SPR和BLI测量。

Significance of Analyte Quality I: Self-Associating Analyte

标准SPR和BLI分析的需求是，在实验中使用的浓度下，分析物需要在溶液中是单体的。上一节解决了不可逆转的汇总材料对分析的极端影响。

配制不良或以其他方式“粘”分析物可以不可逆地自我关联。在这种情况下，分析物的单体处于动态平衡中，小寡聚物（包括二聚体或四聚体），而实际的单体浓度随蛋白质浓度而差异。

The activity and presentation of binding sites influence the effect of the final measurement. The active oligomers can result in overestimates of affinity, and inactive aggregates can produce underestimates (Figure 4). In addition, presentation of multiple binding sites can cause avidity effects and gross overestimates of affinity.

图4。分析物自我关联K_d= 100 nm可以将明显的分析物配体平衡等温线从预期曲线（实线）转移到测量曲线（虚线）。在此分析中，假定二聚体是无活跃的。

Significance of Substrate Protein Quality

大多数汇总分析物可能会导致实验误差，例如聚集的固定蛋白。芯片或纤维探针表面上蛋白质聚集体的存在可能会特别导致活性材料的降低或每固定质量暴露表位的平均数量减少。结果，可以通过聚合的底物蛋白来降低表观亲和力。

Drain Plugger

携带较大颗粒物的材料极为聚集，或其他不纯净的材料会导致另一种效果，即在多通道SPR中堵塞的微流体堵塞。These fluidic channels may be narrow but long, and are susceptible to plugging by agglomerated proteins or other ‘nanocrud.’ The effects of protein expression, purification and preparation can be affected by the occurrence of clogging events in the midst of a screen of dozens or hundreds of candidates.

Plugged microfluidics can be recovered by simply replacing a chip or by using a lengthy system of cleaning and maintenance. The damages, if any, may account to several thousands of dollars.

动态光散射的应用

动态光散射（DLS）是一种非侵入性的，非扰动的光学方法，用于测量溶液/悬浮液中纳米颗粒的尺寸分布，范围从小于1 nm到几微米。DLS基于布朗运动原理，以确定溶液中颗粒的扩散速率。yabo214

动力学^®软件用于将信息转换为粒度分布。然后评估粒径分布以确定SPR微流体是否可以安全地注入溶液，以及SPR或BLI测量结果是否会产生可靠的结果。

The whole process can be quickly carried out before loading it onto the interaction apparatus. The loading is performed by placing the microwell plate into the DynaPro HT-DLS system, running the sample screen, and transferring the same microwell plate onto the SPR or BLI instrument.

because of Brownian motion, molecules and nanoparticles in solution or suspension tend to jitter. At different phases, the light waves scattered by a number of nanoparticles hit the detectors. As a result, they interfere constructively or destructively at the detector based on the presence of specific phase difference between them (Figure 5).

图6显示了扩散系数通过Stokes-Einstein方程向粒径的转化：R_H= k_bT/6πηD_t, where k_bis Boltzmann’s constant, R_H是粒子的流体动力半径，η溶剂粘度和绝对温度。

图5。随着分子通过布朗运动的移动，每个分子散射的光遍历了不同的路径。这会导致在光散射检测器上的建设性或破坏性干扰。当散射的波构造性干扰时，DLS检测器记录了高光强度。相反，当波动破坏性时，检测器记录了低光强度。

Figure 6.自相关分析是将光强度波动与扩散系数联系起来的数学变换。自相关后，动力学将扩散系数转换为大小。

Three typical %-intensity size distributions determined by DLS are shown in Figure 7. The red and blue curves are due to monomodal populations of BSA (R_H= 4 nm）和半径50 nm的聚苯乙烯球体。绿色曲线是由于含有大量单体蛋白R的溶液R_H∼ 4 nm, and some large aggregates with R_Hof about 50 nm.

图7。由DLS确定的代表大小分布。

使用HT-DLS评估

Conventionally, DLS is performed manually in a microcuvette, one sample at a time. Not all of the hundreds of candidates can be screened in this way. The DynaPro Plate Reader II, however, reflects the capabilities of HT-DLS to perform quality assessment for the target and all the candidates. This is due to its microwell-plate based format with in situ, non-perturbative measurements.

Dynapro避免了井之间样品潜在结构的限制。测量时间的时间可能会在每孔10到30 s之间变化，包括井之间的过渡时间。

当在HTS-DLS应用程序中使用动力学时，就将数据作为加热图的配置，具体取决于用户指定的bin定义的差，中间和高质量的大小分布。例如，具有与分析物相关的尺寸的单个狭窄峰的样品可以分类为高质量，并允许以高置信度进一步移动到结合测定法（图8，红色井）。

相邻的样品显示宽阔的单体峰，表明某些低聚物和较低水平的其他颗粒物可以分类为中间质量并允许移动，但具有警告标志以对结果信心（图8，蓝色井）。

在微米大小范围内具有重要颗粒含量的样品可以被污染或容易受到聚集的影响（图8，黑井）。

Figure 8.Visualization of protein quality via heat map in DYNAMICS. Total data acquisition time for 96 wells was < 45 minutes. Data courtesy of Sabin Vaccine Institute and Texas Children’s Hospital Center at Baylor College of Medicine.

Additional Benefits of DLS

作为额外的奖励，DLS固有地确定了扩散系数，这有助于评估传质效应。Dynapro读取器II的另一个独特功能是内置的高磁化摄像头，在进行DLS测量后拍摄了每个井的图片。

These images, stored and shown with the associated DLS data, are especially helpful as diagnostics. Figure 9 shows additional examples of sources of poor data identified by camera images. Finally, the same microwell plates used in the DynaPro may be transferred to a spectroscopic plate reader for additional confirmation of content and quality.

Figure 9.Dynapro's on-board camera helps identify wells containing clean solution and those where sample has precipitated or otherwise can be expected to provide poor data quality.

Sensitivity

每种技术和仪器都有与敏感性有关的问题。DynaPro的检测极限为0.125mg/ml溶菌酶（M = 14.4KDA）。敏感性与摩尔质量成反比，因为大分子散射的光强度与摩尔质量有关。在对聚集体的敏感性时也可以观察到相同的趋势。

即使主要样品浓度在检测极限范围内，DLS也可以用于质量评估，因为它对“纳米乳前”含量的敏感性 - 亚微米颗粒和对结合分析和微富集系统有害的大蛋白质聚集体。

Conclusion

This article concludes that candidate molecules can be selected with the potential for optimal therapeutic effect and patient benefit with respect to a reliable target binding screen, as carried out with SPR or BLI.

Dynapro读取器II提供的高通量动态光散射可以应用于筛选工作流程中，以将解决方案分类为高质量，以最大程度地信心，以对相互作用分析，需要注意的测量值和低质量的不合适的中级质量分析，并可能弄脏测量设备。

The addition of HT-DLS pre-screen can avoid uncertainty and productivity loss related to variable ligand quality. This can result in reliable binding data and confidence on the selection of final candidate.

Reference

Adapted from "Protein Quality Control in SPR and BLI High-Throughput Screening Studies" white paper by Wyatt Technology. Graphs and illustrations reprinted with permission from Wyatt Technology.

此信息已从Wyatt Technology提供的材料中采购，审查和改编。亚博网站下载

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