等温滴定量热法的工作原理

等温滴定量热法（ITC）是一种分析技术，通常被认为是用于分析分子间相互作用的金标准。它是一种滴定法，其是用于定量化学分析的体积技术，其中试剂溶液，滴定剂与分析物或滴度溶液反应。

滴定是在恒定的压力和温度下进行的，这意味着一个单独的ITC实验提供了结合焓、平衡缔合常数和化学计量数的数据，从这些数据可以计算结合熵和吉布斯能。因此，一个ITC实验可以直接获得与相互作用过程相关的关键热力学势——吉布斯能、焓和熵。

研究结合相互作用的ITC

ITC符合一项旨在研究结合相互作用的实验技术的标准要求。ITC直接确定在恒压下反应过程中的热量，Q_T.，与此过程的摩尔焓变ΔH(以非连接态为参考)和形成的大分子配体络合物量成正比:

（1)

在V₀是量热池的体积，和[M]_T.是细胞内大分子的总浓度。第一个条件意味着相互作用焓（即络合物形成焓）不同于零。从第一个条件开始满足第二个条件，如Q_T.与装订过程的推进成正比:

（2）

如果满足以下条件，可以以无意义的方式使用等式1和2以估计结合焓：

• 大分子达到完全饱和，或_L./ M._T.接近1
• 对参考背景热进行适当的减除
• 蛋白质浓度的测定具有合理的准确性

ITC的优势

与其他生物物理技术相比，主要优势是：

• 在一个单一的实验中完成基本的热力学表征(化学计量，缔合常数，结合焓)
• 热量是通用信号，因此，不需要报道标签（例如发色团，荧光团）
• 直接测定结合焓
• 非破坏性技术
• 解决方案中的互动
• 使用光学致密溶液或不寻常系统（如分散液、完整细胞器或细胞）进行实验的可能性
• 在常规滴定实验中，在单个注射实验中的每次注射实验中的0.25h /测定到0.25h /测定的0.25h /测定）。

国际贸易中心的缺点

然而，也有一些缺点:

• 信号与结合焓成比例，非共价复合物可能表现出相当小的结合焓
• 热是一种普遍的信号，每个过程都对全球测量的热有贡献，因此由于约束性，对贡献的评估变得复杂
• 需要大量的样本，虽然这已经大大下降
• 它是一种慢速吞吐量的慢速技术（0.25-2小时/分析），不适合HTS
• 动力学上缓慢的过程可能会被忽略
• 一致测量的结合亲和力的有限范围（结合常数从104-10M^-1用于传统的滴定实验
• 之前，可以访问任何用于绑定交互的动力学信息

基本平衡热力学

当具有单一结合位点的大分子与配体在一定的实验浓度下混合时，可逆结合反应的程度或大分子-配体配合物的浓度[ML]由平衡缔合常数Ka给出:

（3）

K_D.为配合物的平衡解离常数，[M]和[L]分别为游离大分子和配体的浓度。这两个常数都与(标准)结合吉布斯能(ΔG)有关:

（4）

其中T是热力学温度或绝对温度，R是气体常数。

缔合常数越大，解离常数越小，结合吉布斯能越负，形成的配合物越强。

等式3导致致马克 - 配体络合物的摩尔分数与自由配体浓度之间的众所周知的双曲线关系：

（5）

从这个方程，可以推导出形成的大分子配体络合物的浓度，因此，与此形成相关的热可以很容易地通过乘以总蛋白质浓度和摩尔结合焓计算出来。然而，在滴定实验中，游离配体的浓度是未知的，控制的浓度是大分子和配体的总浓度。因此，公式5不能用于滴定分析。

结合吉布斯能可分为焓ΔH和熵TΔS贡献：

（6）

特定相互作用的基本热力学结合曲线包括三个关键的结合参数吉布斯能(由平衡缔合常数K计算得出)_一种），焓和结合的熵。结合这三个热力学潜力提供有关绑定过程的基本和有价值的信息。

结合热力学的直接测量

如前所示，单个ITC实验为给定的结合相互作用提供了完整的基本热力学曲线。实验方法涉及以完全自动化的方式从注射器向细胞内的滴定液溶液（通常为大分子）中进行几次滴定剂注射（通常为配体），同时将系统保持在等压准等温条件下。

通过连续注入配体，化学平衡受到由配体注入引发的反应物浓度增量变化的干扰，并且系统经历了几种组成不同的平衡状态，由于自由大分子和配体结合大分子之间的分配基于平衡（结合或解离）常数以及大分子和配体的总浓度：

（7)

其中下标I表示沿滴定方向的注射次数，每次注射后大分子和配体的总浓度为:

（8)

其中[m]₀和我]₀是细胞中的初始大分子浓度和注射器中配体的浓度，v分别是注射体积，（1- v / v₀）因子是在以恒定体积运行的量热细胞中发生的稀释度。

由配体注入触发的两个连续状态之间的每个转变都与热的吸收或释放有关，热的吸收或释放与由于该注入引起的络合物浓度变化和摩尔焓成比例：

(9)

ITC是一种有限差分或增量技术。

图1显示了具有单个配体结合位点的大分子的典型量热滴定。

图1。用以下绑定参数与大分子结合配体的量热滴定：K_一种= 10⁶m^-1，ΔH= -5千卡/摩尔。上部曲线：热分析器（在量热计中保持零温度差的热功率，显示热量计的样品细胞），显示与每个配体注射相对应的峰的特征序列。下图：结合等温线（作为摩尔比的函数的归一化热量，[L]_T./ [m]_T.，在量热池中。上插图：滴定过程中量热池中游离大分子（开放方块）和大分子配体复合体（封闭方块）摩尔分数的变化。下插图：大分子-配体相互作用的热力学结合曲线；在这种情况下，焓贡献和熵贡献都有利于结合。可以清楚地观察到，最后峰值的平均值不是注射背景热（所谓的“稀释热”）的良好估计值。

可以使用参数n对标称蛋白质浓度进行标准化，以获得非分数n值（图2），因此，“滴定”蛋白质溶液。

图2。大分子浓度不确定度对量热滴定中结合参数估计的影响。(左)N的分数值(0.72±0.01)是通过使用名义浓度(注射器中的配体为230 pM，细胞中的大分子为29 pM)的数据分析获得的。因为在这种情况下，配体浓度被认为是相当准确的，分数值表明，估计的蛋白质浓度过高，误差为28%。采用按照N (21 μ M)归一化的蛋白浓度，可以得到预期的非分数比1:1化学计量(N≈1)(右)。因为只有细胞浓度被改变，缔合常数和结合焓保持不变。如果修改了注射器浓度，这两个参数也会发生变化。

为了在分析实验滴定时适当地应用9式，并获得对结合参数的良好估计，需要解决“稀释热”问题。

有三种方法可以消除这种非比热效应的影响:

• 通过将配体稀释到缓冲剂中进行控制实验并从配体 - 大分子滴定中减去所得的热量;
• 在配体-大分子滴定中平均与最后一次注射（接近大分子饱和）相关的热量，并从数据中减去该值
• 介绍等式9另外的可调参数，QD，注射背景热量

第三种方案是首选方案，因为当存在大分子时，稀释实验无需模拟注射背景效应。

国际贸易中心可获得的定量信息

理论上，可以从单个滴定确定与单个滴定的平衡关联常数，结合焓和化学计量。

然而，该估计的一致性基于结合亲和力和实验设置。可以设置无量纲参数C，其中：

C = K._一种[M]₀=[M]₀/ K._D.

• 如果1 < c < 10000，则可以同时精确地确定这三个绑定参数
• 如果c > 10000，则只能测定结合焓和化学计量比
• 如果c<1，则只能确定平衡缔合常数，因为结合焓和化学计量将相关

图3显示了基于c值的三个不同场景。

图3。不同c值的量热滴定:(左)c = 0.1, K_一种= 10⁴m^-1; (中间）c=100，K_一种10⁷m^{－ 1}；(右)c = 100000, K_一种= 10¹⁰m^-1. 在所有三种情况下：ΔH=-10 kcal/mol[M]₀=晚上10时[L]₀= 100 pM, V₀= 0.2ml，v = 2 pl。由于滴定的进展，插入显示大分子 - 配体复合物（大分子饱和度）的摩尔分数。很明显，低C的情况将是有问题的：非常低的信噪比和具有拟合参数之间的具有潜在相关性的无特色绑定等温度。而且，具有高C的情况将是有问题的：可以估计判断结合亲和力的可能性，并且可以估计关联常数的较低限制值。C和ΔH的值确定了结合等温线的几何特征。In particular, the global deflection of the binding isotherm (difference between the intercept with the y-axis and the heat observed at high saturation, i.e. background or "dilution" heat) is directly related to binding enthalpy, and it is equal to c/(c+1)ΔH.The slope of the binding isotherm at a molar ratio of 1 is directly related to the binding affinity and the binding enthalpy, and it is roughly equal to -0.25c^1/2ΔH。如果C> 1，结合等温线将具有拐点。

由于滴定曲率基于参数C，给予结合亲和力，可以通过选择大分子浓度来调节该曲率。尽管理想情况是1 10000）或非常低（C 1）亲和力，位移滴定，包括中度亲和配体，有助于克服困难。

实验程序可设置如下：

• 通过将每个配体注入大分子中进行两次滴定
• 通过将其中一种配体注入预先结合的第二配体（如果可能的话）预先结合的大分子中，通过将其中一种配体进行第三滴定
• 所有滴定，二元和三元，都可以用单结合位点模型进行分析

恒压下的结合热容是结合焓的温度导数:既不是独立的，也不是竞争的。图4显示了这两个实验系统的过程。

图4。用ITC评估异质相互作用。对于一个大分子结合两种不同的配体，可能有三种情况:独立结合、协同结合和竞争结合(最大负协同性)(左)在没有配体2(封闭方)和有配体2 (220 pM，开放方)的情况下，大分子(30 pM)与配体1 (480 pM)的滴定。T.he analysis of both titrations using a model with a single binding site for ligand 1 provides the following parameters: K_一种1 = 1.1-10⁷m^-1，ΔH₁= -5.2 kcal / mol，k_一种12 = 3.1-10¹m^-1，ΔH₁₂= -8.4 kcal / mol。用配体2（未示出）的第三滴定提供以下参数：K_一种2 = 1.5-10⁵m^-1，ΔH₂=3.1 kcal/mol。由于式15不成立，配体1和配体2的结合不会独立发生。另一方面，考虑205 pM作为自由配体2在配体1滴定过程中的平均浓度，在配体2存在的情况下，应用等式16可计算配体1的结合参数值，K_一种12 = 3.5 -10⁵m^-1和ΔH.₁₂=-8.2 kcal/mol，与直接测定值非常接近（在实验误差范围内）（即满足等式16）。因此，可以得出结论，配体1和配体2竞争性结合（a≈ 0,啊≈ 0). (右图）在配体2不存在（闭合方块）和存在（50μm，开放方块）的情况下，用配体1（260μm）滴定大分子（21μm）。使用带有配体1单一结合位点的模型分析这两种滴定，提供以下参数：K_一种1 = 9.2-10⁵m^-1，ΔH₁= 3.7 kcal / mol，k_一种12 = 2.3-10⁵m^-1，ΔH₁₂=5.3 kcal/mol。使用配体2（未显示）的第三次滴定提供以下参数：K_一种, 2 = 2.7×10⁵m^-1，ΔH₂= -2.1 kcal / mol。因为Eq. 15不成立，配体1和配体2的结合不是独立发生的。另一方面，考虑到40μm作为自由配体2的​​平均浓度沿配体1的滴定，施加当量。可以计算配体2在配体2存在下的1型参数的16值，K_一种, 12 = 7.8×10⁴m^-1和ΔH.₁₂=5.6 kcal/mol，这与直接测定的结果有显著差异（在实验误差范围内）（即，未满足公式16）。因此，可以得出配体1和配体2协同结合的结论。由于配体1的结合亲和力因配体2的存在而降低，因此结合协同性为负。利用式16，可估算协同性参数：α=0.18，Δh=1.6 kcal/mol（即，如果配体2与大分子结合，则配体1的结合亲和力降低5倍，其结合焓增加1.6 kcal/mol）。

通过在pH、温度、离子强度等相同条件下进行ITC实验，并使用具有不同电离焓的缓冲液，可以评估耦合到配体结合的质子交换过程，并估计与缓冲液无关的结合焓和交换的质子净数量。图5显示了这个实验过程。

图5。耦合到配体结合的质子交换构成配体结合相互作用的pH依赖性的分子基础。在使用具有相似PKA但不同电离焓的缓冲剂（管道2.68 kcal / mol，Mops 5.05 kcal / mops 5.05 kcal / mops 5.05 kcal /mol，咪唑8.77 kcal / mol）。因为测量的焓明显依赖于具有负斜率的缓冲液的电离焓，所以结论是，大分子 - 配体络合物的形成伴随着净取料。两个配体的斜率类似，接近1，因此，至少一个质子从复合物中释放到堆积溶液中。然而，对于双配体，缓冲型的凸抗焓显着不同：9.3kcal / mol和0.2kcal / mol。根据当量的情况，在pH 7附近（至少|锥形<2）附近。13 pH的增加/降低将导致对两个配体的结合亲和力增加/降低;特别地，在pH中的1个单元的变化将增加/将平衡关联常数增加10倍，大约。

图6示出了具有恒定结合热容量的特定结合相互作用的热力学结合曲线的温度依赖性。

图6。具有以下结合参数的大分子-配体相互作用的热力学结合曲线的温度依赖性：K_一种= 10⁶m^-1，Ag = -8.2 kcal / mol，Δh= -4 kcal / mol，-tas = -4.2 kcal / mol，ACP = -0.3 kcal / mol。ΔH的斜率等于ACP，而- tas的斜率为-(ACP+AS);由于通常ACP比AS大得多(在实验温度范围内)，所以焓和熵贡献的斜率非常相似，导致结合的吉布斯能对温度不敏感。因此，可以观察到，平衡关联常数显示出的温度几乎没有变化，与通常的实验不确定性一起，使得通过Vace Noff关系非常具有挑战性地估算结合焓。根据Vace't Hoff关系，结合焓在温度Th（在这种情况下，接近12°C），这是最大平衡关联常数的温度。温度Ts（在这种情况下，接近39°C）的熵贡献为零，这是最大吉布斯的结合能量的温度。

结论

ITC是一种强大的工具，用于表征相互作用，尤其是生物分子在广泛的结合亲和力中的相互作用。ITC的不同字段和应用程序是：

• 蛋白质调节和功能
• 蛋白质工程与功能再设计
• 药理学/生物技术靶标表征
• 药物发现中的铅选择
• 药物开发中的铅优化
• 加强治疗用药物载体的研制
• 临床前检测(如血浆蛋白结合，通过不需要的靶点产生的潜在副作用)
• 蛋白质相互作用计算模型发展和改进的实验基准
• 药物，化妆品，食品，清洁和生物技术产业中蛋白质/生物制剂生产质量控制。

此信息已被采购，从Malvern analytical提供的材料进行审核和调整。亚博网站下载

有关此来源的更多信息，请访问马尔弗恩帕尼特．