使用PeakForce轻敲模式原子力显微镜成像DNA双螺旋

使用原子力显微镜(AFM)观察到的第一个生物分子是DNA。对于DNA结构、动力学、拓扑结构以及与蛋白质相互作用的研究，AFM仍是主要的成像技术。

使用独家的PeakForce点击^®通过布鲁克的技术，可以在可以量化的成像力下对DNA双螺旋进行高分辨率成像，而不需要限制性的AFM设计或专门的探针。

原子力显微镜在生物研究中的应用

AFM已广泛用于生物研究，从TAPPMODE™在90年代初推出时。在TappingMode中，探头的振荡在其基本的共振频率下进行，并且尖端的垂直位置连续调节，以保持恒定的振荡幅度，因为探头扫描表面扫描。

在研究生物样本结构时，TappingMode提供了一些好处，但批评者认为，与接触模式成像相比，它提供了低分辨率的生物分子图像。

PeakForce tap模式用于生物分子的常规高分辨率成像

的PeakForce tap AFM成像模式于2010年由布鲁克推出，在很短的时间内，它已被广泛用于研究生物分子。尖端采样距离以正弦运动调制，其振幅通常低于100nm，频率在PeakForce tap模式下为1或2kHz。

如图1a所示，当AFM探针与样品表面接触时，针尖与样品的相互作用是通过保持针尖与样品之间的峰值力或最大力常数来控制的。考虑到探针在Z位置的移动，在样品表面的每个像素位置绘制力曲线(图1b)。

PeakForce点击的好处是，它使用了一个恒定的反馈循环来调整相对的尖端样品位置。PeakForce tap采用正弦斜坡代替线性斜坡，因此当尖端接近表面时，尖端速度接近零。这些特性确保了针尖-样品相互作用力的准确和直接控制，使成像流体在力为100pN或更小。

因此，样品和AFM探针都不会受到损坏。此外，与其他基于力距曲线的成像模式相比，PeakForce tap成像速度更快。每秒成千上万的力曲线可能与峰值力敲击，因为它操作在非常高的频率(1-2kHz)。

图1所示。在峰值力攻丝模式下，AFM探头被调制在低频(1-2 kHz)。(A)当探针与表面接触时，反馈信号是施加于表面的最大或“峰值”力。(B)如果用Z位置来考虑探针的运动，那么本质上就是在样品表面的每个位置上执行一个力曲线。

PeakForce tap技术还启用了自优化ScanAsyst成像模式。使用ScanAsyst，由于成像设定值的优化，可以防止由于悬臂偏转漂移和/或共振峰漂移而在其他AFM工作模式下发生的设定值漂移。

由于每个针尖与样品相互作用点的成像力都是自动优化的，因此使用PeakForce tap技术可以获得高分辨率的图像。伴随着ScanAsyst模式中其他参数的自动优化，例如增益和扫描速率，PeakForce tap使快速和可靠的数据，不管用户的技能水平。

通过对单个病毒衣壳的成像，可以说明PeakForce tap的性能。在以往涉及TappingMode的研究中，病毒粒子的排列是在二维晶体结构中进行的。yabo214

这种二维阵列为病毒粒子提供了机械稳定性，因此当使用AFM探针时，它们不会被破坏。yabo214考虑到病毒衣壳非常脆弱，利用“跳跃模式”可以获得AFM高分辨率图像。

如在Peaking模式下，在跳跃模式下，沿着快速扫描轴创建离散力曲线，其中具有从力曲线导出的地形数据。然而，对于Peakforce攻丝中的每个单独的力曲线，由于由悬臂运动在流体中引起的粘性阻力，因此通过实时反馈回路减去由于悬臂运动引起的粘性拖拉。通过去除背景，可以提高峰值力检测的灵敏度，并且可以部署降低的成像力。

单纯疱疹病毒的Peakfforce攻丝图像如图2所示。蛋白质分子被安排为病毒衣壳表面上的3D亚基并且被称为胶囊。这些现在非常清晰可见。显着的是，这些病毒颗粒的成像是如分离的和单个颗粒进行而没有横向稳定化。yabo214

图2。在缓冲溶液中使用ScanAsyst模式获得的单个单纯疱疹病毒的三维地形图像。在AFM图像(ScanAsyst Fluid+ probe, k~0.7N/m)中可以清楚地看到病毒衣壳表面单个蛋白质分子的空间排列，也称为衣壳。

DNA双螺旋的Peakforce攻丝成像

另一个理想的样本基准PeakForce攻是DNA。它已经被AFM广泛成像，是第一个用于证明TappingMode是理想的生物分子成像样本。DNA由两条多核苷酸链组成，形成双螺旋结构。

B-DNA是DNA的“沃森-克里克”形式，它是右手螺旋的形式，螺旋重复(螺距)为~3.6nm，小槽和大槽宽度分别为~2.2nm和~1.2nm。本文列举了一种技术，通过使用标准悬臂和PeakForce tap可以成像DNA的二级结构。

为了成功图像DNA双螺旋，样品制备非常重要。云母通常用于AFM成像。然而，云母在中性pH下具有负面表面电荷，不允许吸附带负电的DNA。

许多方法已经被应用来克服这一问题，所有的方法都旨在将云母功能化，以形成DNA可以附着的阳性界面。2012年，Leung等人利用1-5mM浓度的NiCl成功成像了一个DNA分子的小槽和大槽₂DNA在云母表面的吸附

这种低浓度减少了对DNA链的不利结构影响，并最大限度地减少了表面污染，然而，它也使DNA松散地结合在云母表面，并为高分辨率成像带来了更大的挑战。

研究人员使用了与Leung等人相同的DNA固定化方法，通过部署Pyne等人实现的PeakForce tap模式可能的低且精确控制的成像力，对松散结合的DNA的螺旋结构进行成像。

PeakForce tap实验在Dimension FastScan Bio, MultiMode 8和BioScope Resolve™原子力显微镜上进行(图3)，使用MSNL-F, FastScan- d, ScanAsyst Fluid+和ScanAsyst Fluid- hr探针，所有这些探针都有标准的硅探针。

图3。使用PeakForce tap和标准AFM探针，DNA双螺旋的成像在布鲁克的所有高性能生物AFM系统上进行了演示:(左)Dimension FastScan BioAFM，(中)MultiMode 8 AFM，(右)BioScope Resolve AFM。

在10mM HEPES, 1mM NiCl, pH 7.4中对MultiMode 8进行PeakForce攻丝成像时，沿着DNA双螺旋小槽和大槽对应的DNA链观察到波纹(图4A)。

图4A显示了BioScope Resolve在相同成像条件下使用ScanAsyst Fluid-HR探头在倒置光显微镜上拍摄的高分辨率图像。图像显示了主沟槽和小沟槽的交替宽度，分别为2.2和1.2nm。

为了评估表面结合DNA的迁移率，在质粒DNA上进行连续的高速TappedMode成像，其在1mm NiCl中固定在云母表面上的₂(图4B)，使用FastScan- d探针和FastScan生物原子力显微镜，其特征是一个标准的硅尖端和一个小悬臂。

图4。（a）使用多模8和MSN1-F探针（K〜0.6n / m）显示在缓冲溶液中拍摄的DNA质粒的攻丝图像，显示与DNA双螺旋的主沟和较小凹槽对应的波纹。插图是使用在倒光学显微镜和扫描液-HR探针上操作的生物镜分辨率获得的DNA质粒的高分辨率图像（K〜0.05n / m）。如虚线所示，沿着股线截取的横截面示出了2.2nm和1.2nm处的交替主体和较小凹槽的宽度。（b）时间序列在攻略中获得的相同类型质粒DNA的高速AFM图像显示，在低Niclconcocteration在连续成像（绿色箭头）下DNA的某些部分保持不动，而相同链的其他部分显示出高度运动程度（红色箭头）。使用FastScan-D探针在FastScan Bio AFM上进行高速成像（K〜0.2N / m）。

沿着DNA长度，可以观察到地形的高度变化，表明DNA链的扭曲(图5A)。这也表明，低镍^2＋浓度使DNA在云母表面保留了更具有生理相关性的结构。

图5。(A)缓冲溶液中PeakForce tap模式捕获的DNA质粒的形貌图。沿着分子的颜色变化(从白色到红色)可以看到局部高度的变化。(B) (i-iii)一个DNA质粒在峰值力分别为39,70和193 pN时的图像，在更高放大倍数下可以看到DNA双螺旋的主要和次要沟槽(插图)。色标:3nm(低放大);2纳米(用于镶嵌)。(iv)在不同的峰值力下，通过DNA测量的高度分布图，如B内的虚线所示。(v)沿分子同一截面测量的高度(如iv)作为峰值力的函数。图5(B)经Pyne等人许可复制。

与其他间歇接触模式相比，PeakForce轻敲的独特优势在于，它可以在任何时候量化成像力。

图5B(i-iii)显示了力对AFM形貌的影响，使用MSNL-F探针在Multimode 8上使用PeakForce tap模式。为了清楚地显示DNA压缩是如何随着尖端取样力的增加而发生的，所有图像的高度比例都保持不变。

在施加最小峰力39pN时，确定的质粒高度接近其晶体结构获得的DNA直径2nm。可能是由于在这些低力下很难跟踪分子，因此在相应的高分辨率图像中，沿着DNA链的长度可以看到非常少量的波纹，如图5B(i)所示。

在施加70pN的力下，观察到大约20%的分子压缩，使质粒的确定高度降至~1.6nm。如图5B(ii)的插图所示，在这种力作用下，可以清楚地看到波纹。小调和大调槽在100pN之后变得不清晰(图5B(iii))，和前面一样TappingMode AFM实验在液体中，测定的高度减小到小于1.5nm。

此时，还存在样品可以从云母表面移位的风险，该云母表面由白色箭头所示的分子运动所示。在图5B（V）中可以看出，测定的高度和用于施加力的高度为约50pn或更低的DNA直径彼此一致，同时需要施加多大的力。

图6显示了使用PeakForce轻敲FastScan Bio和FastScan- d探针捕获的DNA质粒的高分辨率图像。图中显示了与双螺旋结构相对应的波纹。为了进一步研究这一结构，扫描尺寸被缩小到白盒突出显示的较小区域。

图6B显示了该较小扫描区域的高分辨率图像，其中小凹槽和大凹槽清晰可见。在跟踪和回描图像中，双螺旋结构清晰可见，也在随后的几次扫描中显示了时间顺序。白色箭头表示扫描方向。

次要和主要凹槽显示沿着股线的深度变化，它们在跟踪和回溯扫描之间再现并且还在进一步的图像中​​（图6c）。这表明PeakForce攻丝模式不仅可以解析DNA双螺旋的沉阳特征，而且还可以重复地捕获该螺旋结构中的变化。

图6。使用FastScan Bio AFM和FastScan-D探头（小悬臂和标准硅尖）获得的DNA质粒地形中的凹槽深度变化的Peakforce攻丝图像。（a）质粒的低倍率AFM地形图像显示波纹。白色矩形表示在B的B.（b）上成像的面积更高放大迹线（白色箭头到右侧）和追溯（白色箭头到左侧）图像的图像，其显示与DNA的B形式一致的波纹，连续图像。（c）追踪（固体）和追溯（虚线）沿着B的直线截取，如B，紧密遵循四种质粒扫描的骨干，并在5像素（〜0.5）宽度上平均。高度轮廓确认观察到的波纹是双螺旋结构的交替主体和较小凹槽，并且这些凹槽沿DNA股线的深度变化。对于Clarity，高度曲线已被0.6nm的倍数偏移.Color尺度：3.5nm（a），1.1nm（b）。患有Pyne等人的许可。

结论

PeakForce开发模式提供精确的力控制和易于定量的针尖-样品相互作用力，允许在力低于100pN的情况下成像，以便获得流体环境中的软生物样品的高分辨率图像。

通过部署来自Bruker的MultiMode 8、Dimension FastScan Bio和BioScope Resolve原子力显微镜，已经证明PeakForce tap模式能够以高分辨率在单个质粒上成像DNA双螺旋的主要和较小的groves。

此外，已经证明这种亚分子分辨率可以在不需要专门的探针或专门的AFM设计的情况下实现。

这些信息来源于布鲁克纳米表面公司提供的材料。亚博网站下载

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