洞察蛋白质混合物的成分使用Multi-Detection尺寸排阻色谱法(SEC)

Multi-detection尺寸排阻色谱(SEC)结合柱层析法、光散射紫外线(UV)、粘度计和折射率(RI)探测器,使其可靠的分析工具。它简单将multi-detection交会的工作流过程需要蛋白质混合物的有效分析。semi-purified蛋白质混合物包括β-amylase的分析是本文中描述(图1)。

图1所示。多探头色谱的β-amylase甘薯(主要);晶体结构的β-amylase甘薯(插图,PDB ID: 1 fa2)。

亚博网站下载材料和方法

semi-purified混合物的溶液组成的β-amylase从甘薯制备磷酸缓冲盐(pH值7.4),大约2毫克/毫升的浓度。最终的解决方案是然后过滤使用0.2µm醋酸纤维素膜。分析尺寸排除列(2 x Viscotek P3000,莫尔文Panalytical,英国)被用于色谱分离蛋白质混合物。

流动相是磷酸缓冲盐。数据采集是由维护样本,列和探测器25°C。“零浪费”注入模式被用来应用100整除µL到列。一个完整OMNISEC体系OMNISEC揭示探测器模块和OMNISEC解决分离模块被用来执行所有的测量。

结果与讨论

解构Multi-Detection数据的解释

Multi-detection SEC提供有意义的数据。每个探测器显示响应洗脱蛋白分子的特定属性,这些反应都是作为被分析为每个蛋白质指纹特征。

国际扶轮检测

RI探测器中使用传统的洗脱色谱法监测样本组件通过列。国际扶轮的洗脱图β-amylase混合物提出了面板如图2所示。可以清楚地辨别两个主要山峰与各自保留卷(V_R)14.60毫升(1)峰值和15.97毫升(2)峰值。分子洗脱第一大的水动力大小。通过应用大小排斥原理,可以得出的结论是,两个物种有不同的水动力性能。

国际扶轮和光散射信号的组合

浓度探测器的组合和静态光散射检测器使用瑞利方程可以确定分子量。然而,两种不同的表观分子量峰可以比较通过应用更简单的计算原始色谱。从简化的瑞利方程,可以得出结论:表观分子量的分子在不同峰值的比例比光散射信号浓度(LS / C)。

该输入信号的应用multi-detection色谱允许的结论如果LS / C比两个蛋白质的山峰一样,那么他们的表观分子量必须相同。国际扶轮的叠加,光散射信号面板如图2 B所示。有趣的是,文化、C / C和拉尔/比率是一样的两座山峰。

结合国际扶轮检测和粘度测定法

两个条件可以描述这个示例可以生成色谱峰的相同分子量但暂时不同V_R。第一个条件是,样品由β-amylase的两种结构不同的物种有不同的水动力大小。第二个条件是,样本可能由两个不同的蛋白质不同水动力的大小,但在相同的分子量。

粘度计的比例差压(DP)和浓度响应(V_DP评估/ C)以证实这些假设的验证数据,从而确认这些假设不只是文物的运行条件或列退化。一个近似固有粘度值(IV)可以通过V_DP/ C比值从山峰的顶点面板如图2 C所示。自更开放的结构有更高的静脉注射,可以早些时候合理化洗脱峰1和一个更大的水动力的大小。

从浓度探测器洞察力

从浓度探测器获得的数据可以帮助理解上述可能性的最佳代表β-amylase样本。国际扶轮检测器产生信号响应之间的折射率变化流动相洗脱蛋白分子,而紫外检测器产生信号响应的特定波长紫外吸收发色团。

在这两种情况下,这些信号变化的大小比例的蛋白质浓度。然而,可以确定绝对浓度在一个特定的点或下如果相关系数峰值- dn / dc和dA / dc -蛋白质的研究已经知道。蛋白质测量通常涉及使用dn /直流值0.185 mL / g。这意味着对于大多数蛋白质浓度可以直接决定使用国际扶轮。然而,dA /直流是依赖于蛋白质的紫外线的情况下,根据不同的类型和数量的发色团出现在每一个蛋白质分子。

如果两个蛋白质分子是相同的成分,但在水动力大小不同,国际扶轮和紫外信号的比值(RI / UV)将相同的两个蛋白质dn / dc和dA /直流比率是相等的。然而,β-amylase混合物显示不同的RI /紫外线比峰1和2(图2中,面板D)。因为dn / dc对这些蛋白质相对稳定,dA /直流大大有助于国际扶轮/ UV比率的差异,揭示出峰1是一个完全不同的蛋白质,而不是一个β-amylase的聚合。

图2。多探头色谱:(A)国际扶轮响应(红色),(B)覆盖的RI(红色)和光散射响应(绿色和黑色),(C)覆盖的RI(红色)和粘度计响应(蓝色),(D)覆盖的RI(红色)和紫外线(紫色)反应。面板的山峰罪犯被注释的比率、RI, lal RI,粘度计国际扶轮及扶轮紫外线,分别。

图3和表1的结果处理multi-detection数据。两峰分子量非常相似,但不同的水力半径。国际扶轮探测器显示,大约30%的样本混合物峰1和70%的混合物是峰2。摩尔消光系数的甘薯β-amylase,紫外检测器有助于识别峰2β-amylase。这意味着污染蛋白质峰1。

图3。覆盖的多探头色谱兆瓦。

表1。从数据处理总结的定量结果。

参数	Inj。1β淀粉酶
	峰1	峰2
房车(毫升)	14.60	15.97
兆瓦(g /摩尔)	209200年	214200年
Pd ()	1.001	1.001
IVw (dL / g)	0.1572	0.05705
RHw (nm)	8.034	5.771
压裂。样品(%)	28.61	71.39

结论

本文讨论了multi-detection数据的分析获得洞察了β-amylase semi-pure提取的成分。multi-detection数据提供了更有意义的数据可以获得比单个探测器,这将显示样例是一个主要的蛋白质和一些聚合材料的混合物。

相反,multi-detection数据显示,二次峰值不是一个聚合,但实际上一个完全不同的污染的蛋白质。虽然污染蛋白质的分子量是β-amylase一样,其紫外线反应显示,这将是一个不同的分子。粘度计的数据表明,两种蛋白质有不同的结构,导致洗脱体积差异尽管类似的分子量。

尽管这个污染蛋白质的身份仍未揭露的,多探头秒数据有助于得出结论,样品是两个不同的蛋白质的混合物,分子量非常相似。是不可能让这个结论单独任何一个检测器。使用先进的多探头SEC系统等OMNISEC蛋白质领域允许研究人员获得新的见解的复合蛋白质样品和辨别从其他污染物总量,从而使全面的性能表征的纯化蛋白质和理解他们的行为时被用作生物制药药物或化验。

这些信息已经采购,审核并改编自莫尔文Panalytical提供的材料。亚博网站下载

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