使用光散射探测器在蛋白质分析中进行尺寸排除色谱（SEC）

这篇文章介绍了几种检测器，特别是光散射检测器，如何用于蛋白质分析中的尺寸排除色谱(SEC)。SEC广泛应用于生物制药开发，以获得治疗蛋白的成分浓度和分子量(Mw)。

分子量数据对于鉴定和检测低聚物和聚集体在纯度研究和控制高级蛋白质化合物的合成是有用的。在评估安全性、活性和临床疗效时，必须对蛋白质进行精确的分子量测量。

使用单一浓度检测器的常规秒决定了相对于校准标准而不是“绝对”的分子量。这是蛋白质分析的特定问题，与标准不同，正在研究的几种蛋白质不是球状的，所以确定的分子量不确定。然而，光散射检测器允许测量绝对分子量，而不提及所有样品类型的校准标准。

本文研究了光散射检测器如何将光散射检测器添加到多检测器SEC技术中，以进行分子量的一致和鲁棒测量，并进一步了解蛋白质的行为。提出的新研究表明，光散射检测可以帮助去除由于不均匀的样品结构和构象和样本柱相互作用而在传统的SEC中出现的不准确性。

分子量的重要性

蛋白质的药代动力学的几个方面，如临床疗效或生物利用度，是基于分子量分布和分子量。准确的分子量测量对于确保这一点非常重要生物治疗配方定期达到体内性能指标。

在某些情况下，例如形成活性低聚物物种，分子量增加表明成功的蛋白质操纵。仔细跟踪低聚物分子量可以显示哪种蛋白质或组件是最有效的。生物制药工业的关键问题是无意系的蛋白质聚集体的形成，主要是在这里，秒最适合。

研究如何控制聚集对于提供产品安全保障、确保新药商业化的监管审批具有重要意义。

了解SEC如何运作

根据流体力学的大小，SEC分离受到影响。溶解的样品流过用微孔填充材料(通常是惰性硅胶)填充的柱。观察到较大的蛋白质在包装材料中扩散到较少的孔中，并首先洗脱，而较小的蛋白质扩散到较多的孔中，洗脱时间较高。

通过传统的单检测器SEC，外部校准曲线用于确定从记录的保持和浓缩时间数据的相对分子量分布。

SEC可以很容易地使用，并提供优秀的可重复测量的测量。然而，单检测器SEC存在许多问题。

例如，在以下情况下，SEC生成的结果不一致:

• 所使用的参考标准品不具有与样品相同的水动力大小或分子量关系。
• 蛋白质和柱之间的静电相互作用人工延伸洗脱时间并损害分析的可靠性。

此外，单检测器分析提供的蛋白质结构或构象信息非常少。复杂的生物治疗药物的发展，以及对“绝对”分子量测量的相关需求，使得先进的SEC技术得以实现，包括使用大量的检测器来测量分离样品的大小。

先进的多探测器SEC系统包括粘度计和光散射检测器，除了用于绝对MW测量的传统UV或RI浓度分析，无需校准，并且更全面地了解蛋白质结构。通过添加光散射检测器可以直接测量绝对MW。

分子与光束的相互作用导致光散射，强度与其分子量成正比。静态光散射（SLS）检测器确定强度并使用瑞利方程将这些测量转换为MW数据。基于测量散射光的角度，这些检测器称为直角，低角度和多角度光散射（RALS，LALS和MALS）检测器。

在没有外部标准的情况下，用光散射探测器获得的Mw测量值不受保留时间的影响。多探头SEC系统现在还经常具有粘度计，用于提供有关内在粘度或IV的数据。蛋白质形状，结构和水合的修饰，导致分子质量与体积关系的变化，将导致IV变化。

绝对MW和IV的组合使研究人员能够了解这种关联和结构如何随分子量分布的函数而变化。可以使用该数据来区分低聚状态，以确定聚集水平，并观察形状或水合参数。

多探测器SEC的应用

这些案例研究显示了多检测器SEC在提高常规分子量计算的可靠性和对蛋白质结构提供宝贵见解方面的价值和应用。

案例研究1：克服样品矩阵相互作用的影响

第一次研究涉及使用SEC学习蒽乙胺（ALO），由Bacillus炭疽分泌的胚胎形成胆固醇依赖性胞嘧啶。据研究，ALO蛋白可用于炭疽病发病机制，使其成为研究疾病时的重要蛋白质目标。与其他蛋白质类似，ALO显示与几柱填充材料的静电相互作用，其可以人工延长保留时间并影响常规或相对分子量测量的稠度。亚博网站下载

实验：在多检测器SEC系统的帮助下，光散射(LALS/RALS)检测器、粘度计和RI检测器(visitek TDAmax, Malvern Panalytical)进行了实验。Superdex 200样品(GE Healthcare)在含有20 mM Tris、150 mM NaCl的缓冲液中;实验pH为7.3。

结果：ALO单体的色谱图如图1所示。记录保留体积为22.2 mL。这相当于15- 20kda的分子量使用传统校准技术与最相关的标准。光散射数据表明，该ALO的质量平均分子量(Mw)约为53.6 kDa。在没有光散射的情况下，Mw的这种相当大的低估是不容易被探测到的。

图1所示。多检测器SEC系统中蒽酚(ALO)的色谱图显示了UV(紫色)、RALS(绿色)和LALS(黑色)探测器的痕迹;粘度计。同时使用这些方法可以精确测定分子量，并对蛋白质结构提供深入的了解。DP(蓝色)=压差。

同时进行的IV测量提供了对ALO单体结构的深入了解。在前人研究的基础上，提出了分子密度数据可用于估算ALO的形状和水化作用。

获得的结果是：

• MW为53.6 KDA
• IV为5.1毫升/小时

这表明ALO的水合量低，即ALO单体是细长的，并且蛋白质具有折叠的结构。该结论由蛋白质结构X射线分析中观察到的锥形形状。这种洞察力在制剂中有用蛋白质以获得成品中所需的活性。

案例研究2:克服样品结构对样品洗脱体积的影响

几个bcl - 2蛋白质是分子转导器，对内外凋亡信号均敏感，在细胞凋亡或细胞死亡调控中发挥重要作用。

蛋白质聚集导致淀粉样纤维聚集，这与一些神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森氏病有关。

使用单探测器SEC，跟踪聚合过程是困难的，因为随着质量的增加，流体力学体积和半径的变化是不可预测的。

在本研究中，使用光散射检测器进行实验，分析37℃蛋白质培养后体外Bcl-2聚集物的形成，以消除与传统SEC相关的不准确性。

实验：使用vistek TDAmax (Malvern Panalytical)分析仪，在20 mM磷酸钠(pH 8)和150 mM氯化钠缓冲液中分析Superose 6HR (GE Healthcare)样品。在孵育1天和1周后检测聚合过程。

结果：在孵育一天后，在保留体积22.6ml，23.6ml和25.1ml时观察到三种关键物种。光散射的表征显示，这些峰值分别对应于74kDa，51kDa和25kDa的分子量（图2）。发现关键样本群是后一种物种，其与蛋白质的单体状态相对应。

图2。Bcl-2样品色谱图显示在37°C孵育一天后存在三种不同的物种。

在传统色谱柱校准的帮助下，Bcl-2单体的保留时间对应于40 kDa的表观Mw。这表明Bcl-2单体的流体力学半径大于预期。假设样品和柱基质之间的相互作用有限，这种影响可能归因于高蛋白水化或偏离球形。

事实上，Bcl-2是具有八个α螺旋的球状蛋白质和将第一个α螺旋连接到蛋白质的核心的柔性环。这种柔性环在确定样品的洗脱轮廓时起着关键作用，因为它有效地给予蛋白质较大的流体动力半径，而不是预期具有相同MW的紧凑蛋白。

经过一个星期的潜伏期，潜伏期更晚了。结果表明，纤维生长的第一步是形成小团聚体，主要是二聚体和旋聚体，这些小团聚体进一步组装成更大的团聚体。多检测器SEC一致和清晰地识别这些生长聚集物，为蛋白质行为提供有用的洞察力。

结论

这项研究显示了多检测器SEC用于蛋白质分析的好处。使用多个探测器，特别是光散射探测器，优化了SEC实验的信息生产力。使用光散射检测器和粘度计有助于检测和监测分子量和结构的变化，这是单一检测器系统无法做到的。结果数据提高了聚合检测研究的一致性，并扩大了该方法在先进生物制药研究中的应用。

这些信息已经从Malvern Panalytical提供的材料中获得，审查和改编。亚博网站下载

有关此来源的更多信息，请访问马尔弗恩帕尼特．