确定蛋白质样品中的成分及其比例对于改进候选配方和最终配方的表征至关重要。这类信息传统上可以通过粒径排除色谱(SEC)或凝胶渗透色谱(GPC)获得。
SEC通过一套已知分子量的标准，通过大小排除或凝胶渗透柱，比较分析物分子的移动，通过其分子量来识别样品组分。此外，还可以从各自的峰区域提取各组分的相对量。用浓度检测器记录洗脱过程以确定相关的消光系数。
柱校准SEC是一种成熟的技术，但它会引入不准确的分析通过形状依赖的洗脱。相反，多检测SEC，配备了色谱的分辨能力和光散射探测器和粘度计的揭示能力，可以产生更准确的数据和更全面的蛋白质混合物的特性。本文通过对两种抗体样品的表征说明了多检测SEC比柱校准的优越性。
亚博网站下载材料和过程
柱校准标准品在磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)中制备，最终浓度约为1-3 mg/mL，使用一个排除标记和一个由6个球状蛋白组成的蛋白分子量标记试剂盒。然后在最终浓度为2-3mg/mL的PBS中制备两份来自不同有机体的多克隆免疫球蛋白G (IgG)样本。
用0.2µm醋酸纤维素膜过滤所有样品。为了实现体积经济的样品输送，采用微升取样模式，将100µL的三次重复注射到尺寸排除柱集(2x维世泰克P3000, Malvern Panalytical)。使用OMNISEC系统以1 mL/min的流速，以PBS为流动相进行所有测量。数据采集是通过将样品托盘、检测器隔间和色谱柱保持在25°C下进行的。
实验结果
IgG色谱图：折射率
利用折射率检测器监测两种IgG样品的洗脱图谱(图1)。样品进行定性比较，并通过叠加色谱图识别其相对组成。根据尺寸排斥理论，主峰上游保留体积(VR)约为16.0 mL的峰代表了IgG单体的聚集体，其流体力学尺寸逐渐增大。相反，主峰下游的小峰很可能代表具有小流体动力半径的盐分子。
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图1所示。覆盖人IgG（红色）和绵羊IgG的代表性Ri色谱图。（紫色的）
SEC列校准的IgG样本表征
每个蛋白质标准品的分子量的对数(Log Mw)作为蛋白质保留体积与柱空体积(Vo)的比值的函数绘制。通过线性拟合得到校正参数，并用于计算IgG样品色谱中各峰的分子量(图2)。
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图2。SEC柱校准曲线与羊(十字)和人(钻石)IgG数据叠加。
表1总结了这些计算出的Mw值和其他通过柱校准确定的定量属性:
表1。SEC列校准结果摘要。
|
人类免疫球蛋白 |
绵羊IgG. |
| 峰值1 |
峰值2. |
峰值3. |
其他 |
峰值1 |
峰值2. |
其他 |
| VR（ml） |
13.80 |
14.69 |
16.51 |
> 13.00 |
14.60 |
16.44 |
> 13.80 |
| 兆瓦(kDa) |
627.2. |
398.9 |
158.1 |
- |
417.6 |
163.8 |
- |
| 身份 |
四聚物 |
N / D. |
单体 |
高阶总 |
N / D. |
单体 |
高阶总 |
通过多检测秒进行IgG样本表征
表2总结了使用多检测器SEC获得人类和绵羊IgG样品中，示出了绝对M w之间存在良好的一致性，为三聚体，二聚体和单体种类的定量属性的值估计人IgG峰1-3和预期值。同样，针对绵羊IgG峰1和2鉴定的相应MW值符合单体和二聚体物种。
表2。多探测器SEC的结果摘要。
|
|
人类免疫球蛋白 |
绵羊IgG. |
| 峰值1 |
峰值2. |
峰值3. |
其他 |
峰值1 |
峰值2. |
其他 |
| 兆瓦(kDa) |
459.0 |
299.5 |
147.5 |
722.8 |
306.7 |
152.0 |
551.7 |
| Pd |
1.0008 |
1.0002 |
1.0002 |
1.0334. |
1.0010 |
1.0002 |
1.0697 |
| Rh (nm) |
8．2 |
6．7 |
4.8 |
11.0 |
6．8 |
5.0 |
8．8 |
| IV（DL / G） |
0.086 |
0.068 |
0.049 |
0.159 |
0.064 |
0.051 |
0.097 |
| 身份 |
三聚物 |
二聚体 |
单体 |
高阶总 |
二聚体 |
单体 |
高阶总 |
| %的作文 |
2.4 |
11．4 |
84.9 |
1．3 |
11.6 |
85.6 |
2.8 |
粘度计数据允许计算IgG单体的流体动力学半导体。当比较这些值时，两个IgG样品的各自的洗脱顺序是合理化的（图3）。也可以观察到两种分子之间的聚集组合物的变化。与绵羊样品相比，人样品中的较高的三聚物比例可以揭示该样品的稳定性或聚集途径的变化，从而要求进一步分析。
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图3。人羊IgG样品的SEC多检测器色谱图-折射率(红色)，直角光散射(绿色)，低角光散射(黑色)，粘度计(蓝色)，紫外线(紫色)。物种的分子量用橄榄表示。
列校准中的形状依赖性不准确性
结果表明，柱校准SEC得到的分子量值高于多检测器的SEC值。对于代表单体的峰(在这两种情况下)，可以从分子量中识别单体种类。相反，在二聚体等聚集峰中，Mw值与期望值的偏差高达28%，难以确定。
这些不准确性是由于形状对抗体分子的洗脱和它们通过柱基质的聚集体的影响。从尺寸排除理论，流体动力学体积控制蛋白质分子的柱渗透特性，并且是结构和质量的函数。因此，特定分子量的蛋白质可以具有较小的分子量的蛋白质或等效的流体动力学体积，其较低分子量的蛋白质具有密集的填充原子和细长结构。
使用这两种不同形状的分子链来构建校准曲线会得到不同的斜率。球状蛋白在柱定标中的应用使样品具有球状形状的假设。然而，如果抗体的结构是y型而不是球状的，这种假设会导致随着分子尺寸的增加，分子量的错误值。
结论
结果清楚地表明，多检测器SEC优于柱校准SEC。多检测器SEC提供了所有离散峰到特定寡聚态的最终分配，并有助于识别和量化样品之间聚集态的变化。这些数据有助于生物制药制造商确定并洞察各种配方或在各种条件下的各种候选药物的行为特征。因此，最终药物的生产和疗效可以得到有效控制。
Malvern Panalytical的OmniSec系统具有敏感性来测量少数微克或更少的微量微克样品。此外，样品可以在不使用的OmniSEC系统的自动进样器损耗被注入，并且可以在阴凉状态被维持，以避免样品的聚集，同时等待测量。这些功能使OMNISEC系统适用于生物制药和蛋白质。
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