使用MicroCal PEAQ-ITC系统Protein-LMW化合物相互作用的测量和表征

由莫尔文Panalytical2015年3月4日

等温滴定量热法(ITC)可以测量热发射或吸收在绑定蛋白之间的相互作用和低分了重量(流明瓦)配体,药物发现和学术研究领域的关注。

这种能力ITC, protein-small分子相互作用可以不需要研究固定或标签。绑定描述向左反应的变化和熵的贡献ITC的配体是另一个关键应用程序。

新MicroCal PEAQ-ITC系统

广泛的关联范围是一个重大挑战参与绑定交互的描述和量化,因此需要解决。在一个典型的药物发现项目,范围小分子的亲和力值绑定到目标蛋白质从低毫克分子subnanomolar不等。对于学术研究,一个同样广泛的关联范围明显基于生化系统被分析。

绑定交互的特性可以用适当的结合大大简化设计分析和高度敏感的ITC仪器。新莫尔文Panalytical MicroCal PEAQ-ITC系统改善了信号稳定、信噪比和混合特征(图1)。

这些品质与一个复杂的分析设计功能纳入用户友好的数据分析软件优化分析具有挑战性的交互。本文讨论的优点使用MicroCal PEAQ-ITC仪器和软件绑定交互通过直接的调查和竞争滴定。

这个实验比较了新MicroCal PEAQ-ITC早期版本,MicroCal iTC200,通过执行乙酰唑胺与牛碳酸酐酶II的滴定。

研究结果表明,短期内噪声的情况下MicroCal PEAQ-ITC五倍低于MicroCal iTC200。

这个改进数据质量提出了信心在学习挑战数据较低的加热或昂贵或低浓度样品时需要高精度的定量low-nanomolar亲和相互作用。

覆盖原始ITC数据的滴定20µm乙酰唑胺(ACZA) 2µm牛碳酸酐酶II (bCAII)使用MicroCal PEAQ-ITC(上)和MicroCal iTC200(底部)系统。

图1所示。覆盖原始ITC数据的滴定20µm乙酰唑胺(ACZA) 2µm牛碳酸酐酶II (bCAII)使用MicroCal PEAQ-ITC(上)和MicroCal iTC200(底部)系统。

滴定的牛碳酸酐酶II (bCAII)和人类碳酸酐酶(hCAI)进行的抑制剂来演示的适用性PEAQ MicroCal ITC系统绑定交互的描述。图2展示了典型的数据集和表1总结了结果。

生(上)和综合热(底部)情节200年滴定的µm呋喃苯胺酸到20µm bCAII(左)使用2µl注射和25µm ethoxzolamide到2.5µm bCAII使用1µl注射(右)。

图2。生(上)和综合热(底部)情节200年滴定的µm呋喃苯胺酸到20µm bCAII(左)使用2µl注射和25µm ethoxzolamide到2.5µm bCAII使用1µl注射(右)。

表1。总结的结果滴定(n = 3) hCAl和bCAII一系列抑制剂。

蛋白质	化合物,n = 3	N(网站)	错误(N), %	K_D(M)	pK_D	错误(K_D),%	ΔH(千卡/摩尔)	错误(ΔH), %
卫生保健相关感染	磺胺	1.0	固定	3.2 e-04	3.5	16	-5.9	15
卫生保健相关感染	Ethoxzolamide	1.0	1.0	1.9 e-08	7.7	7	-8.7	1
bCAII	呋喃苯胺酸	1.0	1.7	3.6 e-07	6.4	18	-6.3	3
	乙酰唑胺	0.9	0.6	1.8 e-08	7.7	3	-12.6	3
	Ethoxzolamide	0.9	0.3	4.4平台以及	9.4	95年	-14.4	3
	Ethoxzolamide Vinj = 1 uL	1.0	1.0	1.3 e-09	8.8	76年	-15.1	1

所有的相互作用进行了分析使用标准程序注入18.2µl整除的配体进入细胞内的蛋白质的解决方案。错误的K_D都低于20%,不到10%在某些情况下与亲和力的18海里和弱。

焓和化学计量数据的错误也都低于3%以外的磺胺。这些值显示的能力PEAQ MicroCal ITC系统生产高度可再生的数据即使µm低蛋白浓度下降到2.5。

尽管K_D值变化大大ethoxzolamide,紧凑的粘结剂,94%的误差是为这些紧密的互动很好,提供一定数量的信心数据。吸管的低信噪比和高准确度的新MicroCal PEAQ-ITC仪器使使用注射卷1µl一样小。

这种方法使填充更多的数据点的过渡区,从而提高了关联数据质量(图2),在图3中给出的数据是pK_D,这可能是更合适的关联数据比较的方法。

总结KD值获得新的MicroCal PEAQ-ITC仪器和分析软件的一系列流明瓦抑制剂卫生保健相关感染(红色)和bCAII(蓝色)。单位pKD误差显示错误(错误%的KD表1中给出)。

图3。摘要K_D值获得新的MicroCal PEAQ-ITC仪器和分析软件的一系列流明瓦抑制剂卫生保健相关感染(红色)和bCAII(蓝色)。误差线显示错误单位pK_D(错误% K_D表1中给出)。

竞争实验涉及注入强有力的结合配体存在下的靶蛋白弱,竞争力的化合物。ITC滴定,足够数量的数据点不会出现在过渡区较弱的抑制剂时缺席。必须有足够数量的数据点的过渡区,以适合一个独特的绑定等温线。

图4显示了一个注入200µM ethoxzolamide到20µM bCAII 2µl整除。理想的实验条件,保证足够高的热量值更好的信号噪声和足够数量的数据点的转变范围可以通过使用实验设计工具配备的竞争MicroCal PEAQ-ITC(图5)。图4 b显示了生成的滴定。

生(A)和集成ITC数据直接滴定200µM EZA到20µM bCAII和(B)竞争滴定200µM EZA到20µM bCAII和100µM毛皮。

图4。生(A)和集成ITC数据直接滴定200µM EZA到20µM bCAII和(B)竞争滴定200µM EZA到20µM bCAII和100µM毛皮。

结果总结在表2中显示良好之间的协议的绑定参数紧密粘结剂从竞争滴定和获得的数据直接滴定法,证明竞争的适用性实验和表征的设计工具紧密绑定交互。

表2。绑定参数bCA二世与EZA获得直接滴定25µm EZA到2.5µm bCA二世和200年竞争滴定µm EZA到20µm bCA二世与100年预拌µm皮毛,Vinj = 2µl。

实验装置	K_D(nM)	错误(K_D),%	ΔH(千卡每摩尔)	错误(DH), %
直接滴定法	0.4	95年	-14.4	3
竞争滴定	0.4	40	-13.9	6

结果证明的能力Microcal PEAQ-ITC系统为数据提供改进质量。仪器可以量化范围广泛的亲和力由于其高的信噪比。

结果也证明优秀的测量系统的重复性摩尔亲和力。此外,误差约20%或更好的微摩尔的交互显示,前所未有的重复性计算K_D。

使用竞争实验ITC的关联范围延伸至高picomolar范围。错综复杂的实验设计是这种方法的主要缺点。仿真工具MicroCal PEAQ-ITC分析软件简化了设计和分析。

除了改善信噪比,完全自动化的数据分析,减少用户主体性在确凿的数据质量和缩短分析时间的优点MicroCal PEAQ-ITC系统。

确定数据质量和执行合适的几秒钟内每分析使仪器分析大型数据集50或更多的在短时间内分析。

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