使用微量孔Q-ITC仪器来满足药物发现的需求

低分子量配体与蛋白质相互作用的表征和测量在药物开发中至关重要。在描述结合相互作用时，最常见的问题之一是需要评估广泛的结合亲和性(K_D)，并根据作用机理、亲和和相互作用能学对LMW配体进行精确分类和区分。

然而，非活性蛋白的存在或蛋白浓度的错误评估使得结合数据很难得到可靠的解释。这种信息的评估由于复合股票集中的不确定性而进一步复杂化。

等温滴定量热法

等温滴定热量测定法，也称为ITC，可以直接确定在结合过程中吸收或释放的热量。它可以在溶液中研究蛋白质和小分子之间的相互作用，并消除对固定或标记的需要。

结合高灵敏度ITC系统和优化的实验条件，可以帮助证明不准确评估的非活性蛋白组分、蛋白浓度和复合溶液浓度。因此，ITC提供了对生化数据的更好的理解，从QC和分析开发到先导优化。

本文展示了新ITC仪器的好处：MicroCal PEAQ-ITCMicroCal ITC自动化系统和MicroCal PEAQ-ITC分析软件。

改进的特别行政区

活性蛋白浓度测定

ITC从药物发现的初始阶段一直使用到先导物优化的最后阶段。它也可以用于蛋白质纯化QC步骤，以评价批次差异和冻融稳定性。

正控制配体的间歇使用使得在一系列ITC实验中监测蛋白质质量和验证活性蛋白浓度成为可能。

MicroCal PEAQ-ITC分析软件能够为一系列连续的滴定创建结合参数的散点图。这样的图可以确定可能的趋势以及与分析设置和试剂质量有关的潜在问题。

图1所示。将微量PAP-ITC软件产生的N值散射曲线图，用于磷酸盐缓冲盐水（PBS），25℃下的50pM牛碳酸酐酸盐II（BCAII）的一系列连续滴定。实验在微量ITC自动化系统中进行。

图1显示了一组连续ITC滴定获得的N值的散点图，显示了靶蛋白上结合位点的表观数量趋势。N值随时间的稳定下降很可能反映了靶蛋白的稳定性问题。与蛋白质-配体相互作用分析相关的常见问题是批与批之间的变异、有限的蛋白质稳定性和靶蛋白有限的冻融稳定性。

ITC数据对于确定一种相对于早期批次的表观活动（结合）中的一批蛋白质是否不同是重要的，并且提供可能的归一化标准，其在筛选和表征过程中运行许多测定中的助手。

ITC数据研究中使用了活性蛋白浓度，表观化学计量学中的任何残留误差都可以归因于配体浓度测定的不准确。

精确的配体浓度测定

在药物发现中，化合物溶液浓度的给出存在相当大的误差，这些误差直接影响拟合结合信息返回的结合参数的质量，特别是在对结合的熵和焓贡献的准确测定方面。

的MicroCal PEAQ-ITC分析软件使检测和证明化合物浓度的误差成为可能，并有助于减少热力学测量中的任何错误结果。

图2显示了通过ITC确定的化学计量（n）的散射，用于使用微量自动ITC200系统进行的药物发现和开发项目中具有一系列LMW命中的靶蛋白的相互作用。范围在0.2a1.8之间的n值与无活性蛋白质分数不相关。

此外，根据配合物的x射线结构预测了化合物的1:1结合化学计量。很明显，表观化学计量的变化是配体浓度测定不精确的结果。

这些误差影响ITC生成的焓数据，因此很难理解每种配体与靶蛋白相互作用的热力学变化。

图2。案例研究（客户提供的数据）。N值的概述获得靶蛋白与一系列LMW命中在微量自动自动ITC200进行的药物发现和开发项目中的靶蛋白的相互作用。

MicroCal PEAQ-ITC分析软件可以通过使注射器中的低分子量配体浓度不同来证明这一点，同时在拟合过程中将化学计量值设置为1。图3显示了有和没有这个校正因子时返回的焓值数据。

图3。比较药物开发项目中一系列低分子量打击与靶蛋白相互作用的焓值数据，配体浓度校正(浅蓝色)和未校正(深蓝色)。这些化合物按亲和度降序排列。

显然，当研究中考虑配体浓度的误差时，返回的焓数据是完全不同的，这将对先导优化研究的结构活性关系(SAR)的解释产生重大影响。

错误配体浓度的另一个结果是，由于结合等温线的不完整性质，实验可能过于复杂而无法分析，可能需要再次进行。图4给出了一个示例。

图4。用于将LMW配体滴定到配体浓度的蛋白质中有显着误差的蛋白质的ITC数据的实例。原始ITC数据（上限面板）和安装在一个站点相互作用模型（下面板）的集成数据。在没有和（b）的情况下进行配合（a），核算复合浓度误差。下面面板中的插入包含分析软件返回的拟合参数。

的MicroCal PEAQ-ITC分析软件能够适应这些不完整的结合等温线利用恒定偏移，表示在拟合过程中的控制热。

在拟合过程中，通过改变配体浓度和结合控制偏移量，可以以非主观的方式自动研究之前的困难数据集。

在大多数情况下，这对应用来说是足够的，并可以用来确定复合原料药的精确浓度。

在该分析中，预期配体浓度为200μm，但注意到为126μm。此错误对熵（-TAS）和焓（AH）分别对2.28kcal / mol和-2.8 kcal / mole进行了重大影响，而K_D从241μm变为122μm。

这些变化强调了MicroCal PEAQ-ITC分析软件的新功能的价值，以及它将为强大的数据解释带来的优势。

同分异构体和对映异构体的同时亲和力测定

在药物开发的后期，大量化合物以异构体或对映体的混合物形式产生。在大多数情况下，化合物混合物可以通过高效液相色谱(HPLC)分离出来，并且可以单独测试一个或多个异构体。

然而，在某些情况下，分离可能非常困难，需要大量的时间，因此，在这些情况下，有必要直接测试混合物。生化分析提供关于混合物中最紧密结合成分的数据，而ITC在单一实验中同时提供关于弱结合剂和强结合剂的数据。

图5。MicroCal iTC200数据用于将对映体化合物滴定到目标蛋白中(客户提供的数据)。结合等温线明显是双相的;然而，用Origin ITC数据分析数据并不简单。

图5显示了双相结合等温线，展示了在细胞内将对映体配体混合物注射到靶蛋白时ITC信息可能出现的情况。

同样地，当高亲和力配体与弱者配体刻意结合以确定k时，可以看到双相等温。_D超出直接测量范围。

图6。原料和归一化的热图，用于滴定的EZA和毛皮的1：1混合物进入BCaii。在细胞（左）中的注射器中的160pm的化合物的总浓度为160pm的化合物的总浓度，或在细胞（右）中BCaii的浓度为100pm，在细胞中的浓度（右）。制备18×2 Pl注射，缓冲液在25℃下PBS，2V / V％DMSO。

图6中描述的数据表示对映体混合物或“注射器”竞争实验预期的双相等温线数据类型。

因此，这些实验表明了通过MicroCal PEAQ-ITC可以获得的分辨率，并为定量表征混合物的结合提供了可能性。

在MicroCal PEAQ-ITC分析软件的帮助下，与早期模型上可用的分析软件相比，复杂ITC数据的拟合变得更容易。

结论

的MicroCal PEAQ-ITC仪器，连同增强的信号稳定性，信噪比，和混合特性，特征数据分析软件，适合生物物理实验室涉及小分子药物发现。调查是完全自动化的，减少了用户在评估分析过程和数据质量的主观性。

数据质量的评估和拟合过程进行迅速，能够在几秒钟内分析大数据集的实验。MicroCal PEAQ-ITC分析软件的重要特性使得当使用合适的对照时，可以确定配体浓度和目标蛋白的活性浓度。这使得精确地确定热力学和亲和性成为可能，使得在先导物优化和命中验证研究中实现精确的结构-活性关系成为可能。

此外，ITC数据分析软件配备的工具可以简化复杂的结合等温线的拟合，当用对映体混合物滴定时，或用具有多个结合位点的目标滴定时，可以观察到复杂的结合等温线。

这些信息已经从Malvern Panalytical提供的材料中获得，审查和改编。亚博网站下载

有关此来源的更多信息，请访问莫尔文Panalytical．