获得使用ITC酶动力学常数

酶作为生物催化剂的贡献几乎在所有进程发生在活的生物体是显著的。研究酶反应发生在一个系统,分别是至关重要的获得洞察任何生化现象,学习的目标酶的底物的识别过程及其方法作为催化剂产品的形成。了解酶的绑定机制和处理与自然基质需要开发新一代的抑制剂。

在获得酶和底物,测定技术需要开发研究酶催化的反应。这些数据的组合和结构研究数据提供了洞察酶机制。这些知识是有用的开发潜在的抑制剂使用合理的方法。然而,它是一个挑战性的过程开发合适的化验。

解决方案-高灵敏度ITC

高灵敏度ITC是可靠和健壮的技术,可以解决挑战通过允许定量观察Michaelis-Menten相关的酶反应的动力学常数描述系统。作为一个通用的仪器,ITC越来越用来量化协会反应的热力学平衡。

ITC提供了绑定焓(ΔH测量_B)变化可逆的相互作用直接和不使用模型。此外,平衡常数(K_一个)es复杂可以通过精心设计的实验,大致计算的限制步骤是产品形成和化学计量学(n)的反应。因此,几乎完全热力学概要文件可以获得任何双分子的复杂的形成在ITC的帮助。

ITC是一种广泛使用的分析技术分析的酶,催化反应,提供了一个热信号与反应相关联。需要更少的时间完成实验(通常~ 2小时)和消耗更少的材料。本文还探讨了应用ITC催化反应的分析和演示ITC-derived酶反应数据的分析方法来确定酶动力学参数。

量热法和动力学

酶动力学参数可以测量与ITC由于在反应中释放的热能这一事实是一个重大的事件。反应速率随热功率的比例,已表示为时间的函数(dt):权力= dQ / dt。MicroCal VP-ITC最小响应时间为15秒,极快研究许多酶反应速率的过程,避免了需要正确的可测量的热功率量热计的时间常数。

ITC是正常的滴定模式允许做衬底的多个注射,使确定多个利率在一个稳态条件下的实验。此外,现代ITC仪器非常敏感,要求一种酶量类似于分光光度检测但是超过放射性检测。产生的热量转换的“n”摩尔的基质产品表达如下:

在那里,ΔH_应用程序=总摩尔焓实验确定反应;P =产品生成的浓度;和V =反应溶液的体积(细胞体积)。

火电表示如下:

反应速率可以通过重新安排上述方程如下:

反应速率方程表明,有必要确定总摩尔焓和电力(dQ / dt)使用的量热计Michaelis-Menten阴谋。分析使用基于量热法同时提供Michaelis-Menten酶催化反应动力学和热力学数据。

ITC化验

ITC是简单但强大的分析工具允许所有上述的操纵实验条件进行系统描述的酶系统经济和没有标签。使反应物在合适的和良好定义的缓冲系统对所有ITC实验是至关重要的。摩尔浓度的底物和酶需要准确测量进行ITC酶化验使用ITC。确定表观摩尔焓ITC的分析至关重要。也有利于确定确切的摩尔浓度的活跃的酶。准确量化的底物浓度的解决方案也是必需的。

需要执行两种类型的实验以开展ITC化验。第一个实验是持有的总摩尔焓的测定相对大量的酶在细胞和基质在相当低的数量在喷射注射器注射之间提供足够的空间转换的衬底的产品。ΔH_应用程序可以正常地使用合成峰值。

第二个实验是测定反应速率数据持有相当低浓度的酶在细胞中,相对高浓度的底物在喷射注射器注射提供小的差距。目标是保持稳态条件和确保不超过5%的基质是耗尽之前下注射。从这两个数据集,定义的Michaelis-Menten酶参数K_米k_猫和V_马克斯可以导出。

说明性的例子

这个例子展示了丝氨酸/苏氨酸磷酸酶酶率数据(PP1 -γ,参见图1)。ITC是用于分析这个系统。使用如图1所示,PNPP酶底物,上述两种类型的ITC分析。有用的化验结果来确定这种酶,催化反应的速率数据提出了如图2所示。

图1所示。x射线晶体结构的催化亚基PP1(从参考14);活跃的站点,Asn和Asp残留物。(B)活性部位的PP1显示双核的八面体的协调与衔接无机金属离子核心磷酸(产品)。

图2。生热量测量的数据的水解反应速率由PP1-γPNPP。虚线是线性最小二乘最适合注射前的基线。

Microsoft™Excel电子表格™最初是用来分析结果提出了如图2所示。非线性最小二乘分析包起源™5.0用于适应率数据。从这些数据,ΔH_应用程序分别是量化。PPI-γ-PNPP系统的分析结果呈现在图3。加热的衬底稀释用绿色表示上面板。

图3。在顶部面板的红色的山峰是原始量热数据ΔH的决心_应用程序的水解PNPP PP1 -γ。整合这些山峰底部面板中的数据。

这一分析的主要目的是为应用程序验证ITC对这种酶系统动力学分析,并比较ITC-derived酶从其他分析获得的参数的值。出于这个原因,PNPP被选为模型底物,已经有了完善的光谱分析。量热数据评估进行光谱分析的方式类似于ITC化验。

光谱分析来获得初始速度不同的底物浓度建立Michaelis-Menten阴谋。图4给出了结合ITC和光谱数据。两组数据提出了规范化的酶浓度。首先是ITC化验数据速率(表示为蓝线)和第二个类似的数据从分光光度法分析(表示为红线)。蓝线代表一个非线性最小二乘最适合的光谱数据,安装使用以下方程:

图4。水解速率与底物浓度数据的PNPP PP1 -γ。

结论

结果清楚地演示使用ITC定量酶动力学的优势。给定系统,ITC化验数据关联与正常光谱测定数据,证明ITC至高无上的地位比其他方法。除了提供优质酶率数据,反应的热力学量热法措施。这个特性ITC测定拥有潜在的对酶催化反应提供质量和广泛的数据。

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