描述水动力变化在Cation-Binding蛋白质

在许多生物信号通路,小而高度紧张的阳离子促进蛋白质结构变化后绑定。理解这些结构性变化重要的是更好地了解这些信号通路的调控。

单独cation-binding图案通常保存在不同的蛋白质,尽管所控制的信号级联阳离子绑定是大大不同的。毒素“重复”(RTX)是一种阳离子结合主题上发布的病原微生物和现在不同毒力的因素。天冬氨酸和glycine-rich域RTX序列含有一种特殊的Ca^{2 +}结合位点。

这种结合位点的功能是至关重要的分泌毒素,包括adenylatecyclase毒素(CyaA)。CyaA毒素有能力结合钙离子在溶液中。为了促进这些毒素的分泌到细胞外空间,他们可以利用钙依赖性。这是因为新产生的肽必须遍历狭隘的通道的分泌机制。

当细菌胞液中钙的浓度很低,RTX图案将展开构象,分泌创造一个有利的条件。但是,一旦进入细胞外介质,RTX域会被附加到钙离子而形成结构化的蛋白质由于高钙浓度。因此,区分RTX函数的机制,许多生物物理技术是用于检查尺寸和构象的变化CyaA RTX的重复域(RD)后续钙绑定。

分子质量和SEC-TD固有粘度测量

蛋白质和材料准备后,通用电气医疗集团的亚博网站下载Superdex 200列用于执行尺寸排阻色谱法(SEC)实验。由GPCmax控制模块,Superdex 200列有关在线302 tripledetector数组从莫尔文Panalytical (TDA)。

TDA包括以下组件:

• 一个微分式粘度计
• 一个光度计
• 一个微分示差折光检测器
• 静态光散射单元配备两个光电二极管探测器,在90°角光散射(、)和7°低角光散射(lal)

示差折光检测器和光度计被用来确定蛋白质的浓度。分子质量“M”是通过拉尔和文化、数据,以及浓度。使用微分粘度计,固有粘度(η)决心和使用OmniSEC软件固有粘度和分子量测定。

莫尔文Panalytical Zetasizer纳米z仪器是用来进行电泳淌度和电动电势实验。这台仪器显示器前向光散射在17°角。在收购之前,样品和缓冲过滤的过滤器0.2µm大小。RTX多肽浓度变化从70年到130年µm在20毫米生理盐水稀释,pH值7.4和20毫米消息灵通的。Microcuvette ZEN1010和试管DTS1070被用来获得电泳淌度值利用速度场逆转模式。在这种模式下,5到10为每个样本独立测量得到。

为了维持一个测量,质量标准是基于以下参数:

• 相图的质量(频率和振幅弧度)
• ζ质量因素
• 意味着计数率不应改变整个时期的数据采集
• 傅里叶变换的相位图

测量与满意的电泳淌度平均和典型的偏差计算。这样获得的数据被用来生产电泳淌度的分布的每个州的RC_年代和钢筋混凝土_l。

核磁共振光谱(NMR)、圆二色性(CD)和分析超速离心法(AUC)其他技术用于这项研究。

结果与讨论

观察变化的生物物理特性和蛋白质构象重复域(RD)后续钙结合,彻底检查。具体地说,SEC和TDA透露关键数据对肽的行为。这些数据说明如下。

形成有序结构由绑定RD的钙

从核磁共振和远紫外CD方法获得的数据表明,RD无钙出现无序状态,同时RD绑定到钙即Holo-RD形成独特的二级结构。

进一步研究这些变化,证券交易委员会结合TDA是用于整体Apo-RD,其中Apo-RD筛选了在保留体积的10.4毫升(RV)符合折叠蛋白质约600 kda。然而,Holo-RD筛选了房车的13.8毫升,这是接近的预测房车适合的球状蛋白质a和B(图1)。

图1所示。答:紫外吸收曲线(纯)和偏转折射计(虚线曲线)色谱apo-RD holo-RD。b .直角光散射(纯曲线)和差压色谱apo-RD和holo-RD(虚线曲线)。

另一方面,从直角光散射强度数据表明,分子质量没有改变,表明房车的变化不是归因于齐聚的蛋白质(图1 b)。此外,微分粘度计的大小山峰是截然不同的两个国家之间生产固有粘度(η)35.1 ml.g值¹和5.5 ml.g¹分别为Apo-RD Holo-RD。这对于Apo-RD论述了高价值低房车,鉴于房车与流体力学体积有关。

使用AUC方法进一步研究证实,Apo-RD Holo-RD沉降系数不同,但相同的分子质量73 kda。这些数据还显示一个水力半径(R_H)6.5和3.2 nm Apo-RD Holo-RD,分别和证明后钙绑定,RD转换从一个无序肽结构变成一个紧密形成多肽二级结构下了命令。

描述所需的地区钙诱导结构改变

的CyaA的路包含大约40 RTX图案排列成连续5块,每个块c端和氨基端侧翼区域隔开。肽的序列构造(图2)是如何制作的,以描述这些侧翼区域为calcium-dependant结构性变化。

图2

从色氨酸荧光和CD获得的数据显示,钙的存在并没有改变域R和NR。所有的结构构造由c端侧翼地区获得了二级结构之后的钙。因此,n端无法参与,而c端地区所需的钙引起的二级结构的形成。

进一步研究calcium-induced变化,SEC-TD是用来比较calcium-insensitive (R)和calcium-sensitive (RC_l)肽(图3)。钙绑定后,RC_l显示特性粘度和房车的变化(图3 a、C),这表明减少R_H。另一方面,从文化、获得数据和微分折射计显示的分子质量保持不变,并在协议与单体形式。

与钢筋混凝土_l域,R域显示钙依赖的所有测量参数(图3 b, D),包括文化、房车、差压信号和差示折光计信号。

图3

因此,钙的加入并没有产生任何重大的变化_H固有粘度或分子质量R域。这支持结论,c端侧翼地区扮演重要的角色在calcium-induced域结构的变化。

Calcium-Induced寡聚物的形成

从AUC方法获得的数据表明,R_H并没有改变后续钙绑定,同时数据从CD光谱方法检测到的变化之间的光谱Holo-RC吗_年代和Apo-RCS。为了理解这些模棱两可,SEC-TD分析RC_年代域。与钢筋混凝土_l(图3 a、C),钢筋混凝土_年代保持不变在房车后续钙结合,表明Holo-RC_年代和Apo-RC_年代表现出类似的水动力卷,如图4所示。

图4

微分折射计和所获得的资料、证明Apo-RC_年代和Holo-RC_年代表现出15.1 kda的分子质量类似于单体,42 kda的分子质量类似于三聚物的形成,分别。从14.7到6.4 ml.g固有粘度降低¹随后的钙绑定。这些数据表明钢筋混凝土的致密三聚物的形成_年代随后的钙绑定。

结论

为了理解信号通路的规定,重要的是要理解结构变化引起的阳离子绑定。上述数据表明,不同类型的生物物理技术可用于区分大小的变化,电荷和构象的蛋白质钙后绑定。

特别是应用SEC-TD帮助解释了固有粘度,大小和分子量的肽利用整个研究。这些数据不仅帮助识别的变化促进了钙绑定,也协助识别所需的图案和域引起这些变化。同时,申请电动电势测量有助于理解肽之间的交互和带电离子。

这些信息已经采购,审核并改编自莫尔文Panalytical提供的材料。亚博网站下载

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