使用多探头交会分析膜蛋白

凝胶排阻色谱(SEC)是一种色谱技术通常利用在生物科学领域。亚博老虎机网登录

这种方法通常是采用确定样品的分子量通过引用的洗脱时间未知的分子量与已知分子量的标准。执行本程序使用浓度检测器如折射率(RI)或紫外线(UV)。

现在,复杂的多探头秒解决方案有四探测器如RI、紫外线,固有粘度(LV)、光散射(LS)。在这篇文章中,一个细菌膜蛋白和纯化膜蛋白样本特征通过Viscotek TDAmax系统(图1),一个全面的交会与紫外线系统,RI, LS IV探测器。

图1所示。TDAmax系统。

光散射和固有粘度

特性粘度的定义是衡量分子密度和有助于评估结构性变化。

光散射检测器有助于确定分子量和列校准的必要性。固有粘度与光散射可以测量尺寸(R_h)。是很重要的保持灵敏度的探测器,这样高水平保持在所有四个探测器。

在分子生物学研究中,膜蛋白的研究越来越被执行。这些研究的一个关键目标是蛋白质的结晶。然而,这个过程是非常复杂的,因为结晶膜蛋白依赖很多因素如纯净的蛋白质和洗涤剂类型或浓度。当过量的蛋白质的洗涤剂成分复杂的了,它能降解蛋白质,从而降低结晶的可能性。

因此,描述和优化的洗涤剂和蛋白质在膜蛋白的纯化样品可以提供一个更好的了解结晶的可能性以及对蛋白质的洗涤剂的内容复杂的(PDC)。

实验框架

样品净化使用n-dodecylß-D-maltoside (DDM)洗涤剂。PBS添加0.02% w / v DDM作为流动相,样品被隔离在通用电气Superdex 200秒列。

OmniSEC的共聚体分析是利用雇员的dA /直流和dn /直流洗涤剂和蛋白质的浓度和分子量的组件的每一个数据块沿色谱。dn / dc的蛋白质,值为0.185 ml / g是利用预测及其消光系数是0.5 (A280;1毫克/毫升)。先前的研究已经证明了DDM的dn / dc 0.1608 ml / g值及其消光系数的计算是0.0044 (A280;1毫克/毫升)。

结果与讨论

考虑到只有少量的纯化蛋白用于考试,牛血清白蛋白(BSA)是用于研究蛋白质的胶束行为和系统上的洗涤剂。蛋白质的分子量是用于校准仪器的检测器的响应。然后,剩余数量的纯DDM微粒运行来确定它们的大小和分子量。色谱的DDM, BSA和两个在一起是如图2所示。

图2。从上到下,BSA的色谱,DDM和上面两种声音的混合。

从上面的图,两个样品被洗提在不同的卷,两者之间呈现理性解决。同时,DDM极低的信号,同时BSA显示相当大的吸收UV通道(280海里)。这是明显的从色谱样品都是单独在一起,跑。

BSA的分子量计算是67 kda。当单独测量,DDM胶束大小为2.5 nm和量化60 kda的分子量。DDM和BSA同时测量时,增加一个小DDM分子量(65 kda)是观察。这可能是由于限制分辨率在两座山峰之间。

膜蛋白是注入DDM和BSA被发现后适当的系统上运行。蛋白质浓度为0.5毫克/毫升和100年µl加载。在一个高峰,肩膀的样本筛选了提升边缘符合国际扶轮。这个肩膀与大部分的紫外线信号,区分它的蛋白质洗涤剂复杂(PDC),而峰值的主体有少量的紫外线信号,暗示这是DDM胶束,如图3所示。

图3。色谱的细菌多膜蛋白。

峰的区域无紫外吸光度的大小2.6 nm,测量分子量62.5 kda,因此区分DDM胶束。紫外线峰值和肩膀是公认为PDC和74.5 kda分子量。检查共轭,PDC的数量在整个样本测量是21.6%,而DDM微粒中含有78.4%的标本。PDC是量化占DDM和蛋白质的54%和46%,分别。蛋白质的分子量被发现33 kda,靠近的估计蛋白质包含46%的PDC和提供优秀的验证结果。

的两个组件,可以测量和绘制浓度派生色谱显示组件的浓度探测器响应(图4)。

图4。派生的色谱图显示蛋白质的浓度(紫色)和DDM(蓝色)。测定分子量是绘制在两座山峰。

这给了一个很好的可视化表示样品的成分。在这种情况下,很明显,蛋白质的浓度是DDM微粒相比要低得多。此外,很明显,大部分DDM PDC不是,但在免费的胶束。同时,派生的色谱图,两峰已经绘制的分子量。

结论

使用Viscotek TDAmax系统洗涤剂的蛋白质复杂的特点是发生在细菌多膜蛋白的纯化DDM的存在。的分子量免费DDM胶束和PDC。此外,PDC的作文DDM和蛋白质含量测定和观察到接近预期。

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