DLS/Raman光谱调查单克隆反体热稳定性

开发生物药剂产品时,热稳定性特征描述是优化单克隆抗体及其配方的关键步骤标准技术描述热行为,称为差扫描卡路里测量技术提供尾调,从中可导出稳定性和热动特性

为了减少加热期间的聚合值,DSC样本通常低浓度运行,因此这一技术对测试高浓度稳定性无效,高浓度特征即配方产品特征假设聚积不因加热这些低浓度样本而产生无法从所得数据证实这一点,带视觉汇总信号样本通常是DSC运行的最终产物。

Raman光谱学和动态光散射综合法帮助分析配方富集热稳定性,帮助辨别浮点和聚合事件

mAbs二级结构相当稳定,因为结构框架丰富p表,共价除硫债券进一步稳定单靠热压力并不足以干扰二级结构文章比较修改单克隆抗体热稳定性和相关模板单克隆抗体热稳定性

亚博网站下载方法与材料

马尔文剖析法Zetasizer Helix内含纤维相联拉曼分光计和Zetasizer NanoZSP提供 Raman(构型稳定性)和DLS(染色稳定性)单样本序列数据Zetasizer纳米系统整合非渗透反射检测技术与电光分解,静态光分解和动态光分解,以确定蛋白体运动半径从0.15纳米到5微米,从0.1 mg/m使用 785nmexcement (~280mW)^-1至1925cm^-14m^-1分辨率收集raman光谱

mAb和mAb10mm样本保留在4摄氏度直至研究完成样本aliquts(~120ml)转入3毫米Quertzcutte并置入从0°C到90°C++0.10C提供温度控件的区块

热斜坡研究后通过获取DLS和Raman数据进行预定义0.1°C-5°C阶梯增量下一步,通过获取一组DLS和Raman数据,在优先温度定点预定时间段内进行异热孵化研究。

结果与讨论

光谱镜像

mAb和mmAb样本加热后,通过检测其大小和结构特征raman和DLS整段实验图1显示拉曼光谱mAb和mmAb样本高低温度并证实分子二级结构的稳定性光谱区域与这些相容性相关,特别是Amide一区和三区不显示相当大的峰值移位或变换,但显示Amide一区略带宽度

图1代表拉曼光谱单克隆抗体(A)及其修改版(B)热应激前后

mAb/mmAb二级结构模型可部分最小方块分析使用光谱从参考蛋白样本获取并已知二级结构元件以预测未知蛋白样本二级结构

图2显示模型预测四大结构图的温度依赖性:p表、p转转转、a-hellix和随机卷转mAb(图1A)和mAb(图1B)。微光谱和结构变化观察后,可看到MMAB和MAB显示不同行为(图2)。

图2单克隆抗体预测二次结构百分数不同颜色迹显示不同结构元素的变化

图2C中MMAB显示低发温度,双转时间分别为~50°C和65°C,而MAB显示单然转近70°C这表明MMAB和MAB对热应力反应不同,尽管直接比较光谱并看不出这一点

有趣的是,Trusine和triptophan显示 mAb和mmAb有相当大的差别图3A显示,光谱标记显示toptophan侧链和dole环平面间二角mamAb在~66摄氏度时先发制人,过渡范围非常广

图3光谱标记搭建峰值表示单片环和单片联结平面之间的二角光谱标记描述暴波侧链环境

图3B观测到额外差分,图3B绘制频谱标记描述交替带氢环境mAb再次显示在~69摄氏度有锐化转换

mamAb微量显示双重转换点为~53摄氏度和~62摄氏度观察结果加上二级结构所观察到的相容稳定性显示,逆序侧链可能导致早期相容变化,导致低热稳定性

动态光散射

虽然光谱镜像提供结构变化洞察力,它不处理由聚合和热应激期间展开的大小变化Raman和DLS综合法帮助同时研究这两个重要特征

图4平均体积和多差指数PDI从动态光散射中产生DLS绘制单克隆反体(蓝微量)及其修改版(红微量)视温度函数

图4A显示,mAb聚合起始温度高于mAb,再次显示高热稳定性mmAb显示与Raman数据所观测到的相同双向转换,特别是对于yrosine H-bonding环境

DLSZ平均尺寸数据显示,低温转换是在~50摄氏度上发生的寡头事件,而 mAb样本>70摄氏度显示,mAb高温转换为快速聚合事件

图4B中PDI趋势一致mAb样本PDI约0.1直到单点不等,在~60摄氏度观察大增表示mmAb样本在初始转换期间形成寡头,这些寡头反过来形成二次转换时指定的大集合观察结果与上文描述的拉曼数据一致。

DLS技术不仅决定大小本身,还决定大小分布,这不可能因扰动性测量或静态光散

同热编译

上表结果显示,MMAB和MAB热稳定性剖面变换是由于第三层结构演化导致MMAB解析然而,这一进程的动能和寡头的稳定性仍然不明朗。为此目的,在过渡前(46摄氏度)、过渡中(53摄氏度)和过渡后(60摄氏度)温度上演异热演化结果显示图5

图5mamAb自DLS数据推导为Z平均尺寸的异热孵化研究悬浮峰值tryptophan峰值位置不同的孵化温度显示为蓝(46摄氏度)、红(53摄氏度)和绿迹(60摄氏度),绘制时函数

向过渡前温度嵌入时体积渐增treptophan和trusineramanmaser带不显示大峰值移位但在53摄氏度时,大小从10摄氏度快速上升至~35摄氏度并稳定并发峰值下降 复元峰值略微移动

观察结果再次支持经修改或新添加的暴风残留物在低温下引起寡头化的想法,最终导致MMAB热稳定性下降。

结论

DLS和光谱镜像清晰显示测试mAbs显示二分结构转换剖面与模型球状蛋白mAbs中芳香侧链残留物显示清晰结构相容转换热应力,修改mAb热稳定性低于mAb此外,寡头化机制似乎是由tyrosine侧链结构变化触发的,寡头组成者稳定不散,不会因冷却而分解。

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