使用尺寸排阻色谱法来克服负面影响分子量的蛋白质结构测量

尺寸排阻色谱(SEC)是一种证明方法,分子量(MW或摩尔质量)测量蛋白质,通常涉及的列保留体积的比较样本对一系列已知MW标准。

由于流体力学体积分子(不是分子量)实际上控制交会的分离过程,随后的结果只是相对于采用标准的校准系统。

如何关闭“相对”的实际兆瓦兆瓦是样本之间的相似程度是受标准和分析物结构。因此,任何差异结构将产生负面影响结果的准确性。

此外,某些蛋白质的交互作用列矩阵及其趋势改变流体力学体积在洗脱的保留体积无效计算测量分子的兆瓦。

复杂的探测器与色谱系统的集成使测量的绝对MW样本独立于任何标准或样品洗脱体积。

本文给出了两个例子说明了不适用的保留体积样品获得准确的分子量测定。它还描述了先进的探测器的能力获得额外的信息。

仪表

一个Viscotek TDAmax系统,包括一个三探测器阵列(TDA)连接到一个GPCmax脱气装置,autosampler模块,使用泵和SEC列,在这些例子。牛血清白蛋白(BSA)注射受雇于inter-detector延迟量的测定,频带展宽修正因素,和校准常数。OmniSEC软件是用于控制整个系统和收购TDA的五个探测器的信号系统。

TDA的五个探测器系统包括一个差压(DP)惠斯通电桥式粘度计,一个微分折射计(RI), 90°角光散射(、)和7°低角度光散射(lal)探测器量化静态光散射强度和紫外可见分光光度计。

绝对分子量(MW)和蛋白质的固有粘度(IV)计算使用OmniSEC从五个探测器的测量软件。

实验结果

绝对分子量测量后样品基体的相互作用

在这个分析中,Anthrolysin(氧化铝)进行了研究。SEC实验用Superdex 200(通用电气医疗集团)与一个缓冲区组成的150毫米氯化钠,20毫米三。

MW和IV氧化铝在溶液中测定使用Viscotek TDA和这项研究的结果发表在图1 a和1 b。线在图1的数据显示紫外线(紫色)、(绿色),拉尔(黑色),和DP(蓝色)。B分子重量(MW)和固有粘度(IV)氧化铝的模式。数据在图1 b行显示分子量(黑色),紫外线(紫色),四(灰色)。

图1所示。答:色谱的氧化铝Viscotek TDAmax。b .分子量(MW)和固有粘度(IV)氧化铝的模式。

计算绝对MW 53.6 kDa,显示氧化铝在溶液中以单体的形式存在。相反,MW测量与传统列标定方法会产生一个值仅15 - 20 kDa,因此需要使用光散射探测器来避免这种低估兆瓦。

样品的IV决心使用在线微分粘度计。氧化铝的第四测量值是5.1 mL / g。比较与BSA第四单体MW 66.5 kDa,约3.2 mL / g显示,氧化铝具有较低的密度和更开放的结构。

第四测量中可以利用的水力半径的计算示例。氧化铝是高于预计将比BSA揭示与列的交互。

样品结构样品洗脱体积的影响

传统的交会分析不能证明结构感兴趣的分析物和标准之间的差异。这个例子是聚合物的体外形成由孵化bcl - 2蛋白的蛋白质在37°C。在聚合过程中发生的早期事件之后孵化了1天,1周的特点用秒Superose 6小时(通用电气医疗集团),150毫米氯化钠,20毫米磷酸钠的缓冲区。

三重特征检测色谱一天的孵化后37°C是如图2所示。插图显示的MW分布不同的组件内的样本。

图2。色谱的bcl - 2 Viscotek TDAmax。、(绿线)和示差折光检测器(红线)。

三个主要的物种保留量的测定22.6,23.6,和25.1毫升的多工作站系统74±3 kDa, 51±2 kDa,分别和25±2 kDa。的单体的形式蛋白质的主要人口样本。

是可观测的肩膀三峰,代表一个小人口四聚物。其他物种测定洗脱时11毫升的光散射探测器。这是一个特征反应对蛋白质总量很高兆瓦,但是低浓度。

bcl - 2 MW测量的单体与传统列标定方法会产生一个值只有40 kDa,这表明bcl - 2具有较高的水力半径比预期(RH)虽然是单体的。假设样本没有与列矩阵,这种效应可能发生由于偏离球形和/或蛋白质的水合作用。

样品的分析孵化一周在37°C透露更多的聚合物的形成。根据美国证券交易委员会(SEC)分析,形成小骨料(主要是二聚体和三聚)纤维发展的第一步。这些小总量进一步组装成更大的聚集。

结论

证券交易委员会是一个有用的技术来获得洞察蛋白质和它们的功能。本文讨论了利用传统的缺点列在分子量测量校准技术。

结果显示multi-detection系统的能力来确定蛋白质及其低聚物的绝对MW无论保留卷或任何用于校准标准。

他们还表明,这种复杂的方法能够区分聚合程度,低聚物的状态、形状差异或水化样品。

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