偏振化衰减反射或ATR是确定大量样品的取向，但更难以施加到真丝纤维的真正小样品的方向的有效技术。
利用金刚石作为ATR元件和聚焦光束的金门单反射ATR附件，可以有效地定量研究直径约为10μm的家蚕单丝蛋白丝的构象和取向。
采用三种方法测定分子取向。最常见的方法是将样品固定在ATR上，并旋转入射辐射的电场。这种方法可以实现，因为样品不需要移动，但它需要完全了解ATR晶体表面每个方向上的电场分量。
样品制备
来自家蚕B. Mori的茧从加拿大森林服务的昆虫生产单位获得（Sault Ste。Marie，安大略省，加拿大）。Raw B. Mori丝用蛋白质丝蛋白的固井层组成的两个纤维素长丝。为了除去硅蛋白层，在含有碳酸氢钠（0.05％w / v）的沸水中进行钙丝的脱胶，含有15min。
为了除去多余的水，将得到的纤维素长丝用去离子水彻底冲洗，并在真空下干燥几分钟。样品储存在22±1℃和65±5％相对湿度下进行。
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图1所示。用于样品旋转和二色性测量的坐标系统和机械设置显示了角轮(A)、支撑桥(B)、轴(Z)和标高挡板(F)。
用于样品安装和旋转的机械设置
在入射光的电场与纤维轴的夹角范围内，通过旋转记录样品的极化ATR光谱。对金门ATR附件轴进行了修改，以适应图1所示的样品支架，以便在所有光谱中，样品和ATR元件之间重复具有几乎相同的接触。
样品支架包括由氟化钡(BaF)形成的砧2)的磁盘附着在一个相同直径的塑料支架与双面胶布。蚕丝纤维位于BaF的中心2通过对纤维施加很小的张力，使纤维保持挺直，避免纤维收缩，将基材两端用胶带轻轻贴在塑料支架的一侧。
一个圆形法兰被用来将样品夹附在ATR附件的桥(B)轴上。在铝法兰和塑料支架之间，插入了一块柔软的低密度聚氨酯泡沫，以确保对样品应用可重复低压。
光谱习得和治疗
Nicolet Magna 850傅里叶变换红外光谱仪用于用液氮冷却窄带汞镉（MCT）检测器和金门ATR配件的光谱记录光谱。该装置中的红外光束聚焦到具有ZnSe透镜（4x放大倍数）的金刚石晶体上的750μm。垂直于入射平面，使用ZnSe线栅偏振器偏振电场。从128次扫描以4厘米的分辨率－1，每个光谱都是通过hap - genzel apodization获得的。
根据红外辐射穿透深度的波长依赖性，对所有光谱进行了校正。在克中使用的频带拟合迭代程序是基于一种称为Levenberg-Marquardt方法的非线性算法。
结果与讨论
图2显示了950 ~ 1750 cm之间的ATR光谱－1在从纤维的不同旋转角度的S-偏振光下并由0°（平行于电场平行）的不同旋转角度的S偏振光并平行于90°（垂直于电场的光纤）的单纤维素茧丝。
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图2。采用s偏光光在纤维从0°(平行于电场的纤维)到90°(垂直于电场的纤维)不同旋转角度下获得的单根桑蚕丝纤维的ATR光谱。
表1中给出了B. Mori Silk的主要条带的分配。
表格1。B. Mori丝偏振ATR光谱中观察条带的分配和取向依赖性。
| 位置(cm1） |
作业 |
优惠的定向 |
参考文献 |
| 1698 |
酰胺,β床单 |
为 |
15,22,45,415,22,45,46 |
| 1649 |
酰胺我unordere |
|
26, 47岁 |
| 1615. |
酰胺,β床单 |
⊥ |
5日,22日,28日,32 |
| 1594 |
N(碳碳)戒指,tyrosinN(酪氨酸 |
|
30,48 |
| 1555 |
酰胺二世,β床单 |
⊥ |
22日24 |
| 1527 |
酰胺II，无序的yrosine |
|
24日26日27日,29岁 |
| 1515 |
v(C-C)和δ(CH)，酪氨酸 |
|
30,31 |
| 1505. |
酰胺二世,β床单 |
为 |
24-29 |
| 1469 |
δ作为(CH3.)、丙氨酸、β床单 |
为 |
22日,30 |
| 1447 |
δ(CH2), (AG)n |
|
22 |
| 1437 |
δ(CH2), (AG)nβ表 |
⊥ |
22 |
| 1406 |
W (CαH2), (AG)n |
为 |
22日,49 |
| 1369 |
δ年代(CH3.), (AG)n |
|
22 |
| 1335 |
δ年代(CH3.), (AG)n |
|
22 |
| 1260 |
酰胺三世,β床单 |
|
22,29,32-34 |
| 1225 |
酰胺三，无序 |
|
29、32、33 |
| 1161. |
v (cα)和6 (Hα), (AG)n |
为 |
22 |
| 1103 |
酪氨酸 |
|
32 |
| 1070. |
v(碳碳) |
|
32 |
| 1055. |
v(碳碳) |
|
32 |
| 1014 |
r（ch.2），酪氨酸 |
|
32 |
| 996 |
r（ch.2), (AG)nβ表 |
为 |
22日,32 |
| 973. |
r（ch.2), (AG)nβ表 |
为 |
22日,32 |
一个使用的缩写:v，拉伸;d,弯曲;w,摇;r,摇摆;作为不对称;年代,对称的。
图3显示了在0°和90°处对准的纤维的典型分解光谱。这些光谱清楚地证实，自1615和1698厘米以来，β-纸张在B. Mori Silk中高度取向－1分量分别在0°和90°光谱中几乎完全消失。
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图3。对桑蚕丝在0°和90°的实验光谱进行了分解
图4显示了各组分在1615、1649、1698 cm处的实验吸光度－1画出θ的函数。
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图4。综合吸光度为1615、1649、1698 cm－1纤维轴与红外辐射电场之间夹角θ的波段分量。与式1的相关性也显示出来。
对于特定的振动吸光度与跃迁矩(M)与红外辐射电场(E)之间的标量积的平方成正比，吸光度应遵循纤维轴分量之间夹角θ的余弦平方函数，如下:
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哪里A.为和一个⊥当红外辐射被平行（0°）偏振并分别垂直（90°）到光纤轴线时是测量的吸光度，并且δ是占据光纤角定位中误差的相位因子。
等式2用于获得二向色比R，允许计算第二矩P2(因为γ)或P2cos γ中以Legendre多项式的和表示的取向分布函数，其中γ是方程3中M和E之间的夹角。
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表2给出了R和(< P2>）确定为1615,1649和1698厘米－1乐队。
表2.．偏振吸光度（A和A），二色性配给（R），订单参数（2由式1拟合得到酰胺I带主要组分的相对面积。
| 位置(cm－1） |
宽度(cm－1） |
一个为 |
一个⊥ |
R |
< P2> |
集成的吸光度(0） |
相对面积 |
| 1698 |
15 |
0.0114±0.0002 |
0.0024±0.0002 |
4.7±0.05 |
0.56±0.04 |
0.0056±0.0006 |
3±1% |
| 1649 |
64 |
0.080±0.001 |
0.092±0.001 |
0.87±0.03 |
-0.04±0.02 |
0.088±0.003 |
51±2% |
| 1615. |
35 |
0.0052±0.0007. |
0.1178±0.0004 |
0.04±0.01 |
-0.46±0.01 |
0.082±0.001 |
46±2% |
为了获得更多的洞察丝纤维素的构象，定向无关或结构吸光度谱（a0)可由平行和垂直偏振光谱用公式4计算。
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图5显示了a为和一个⊥五种不同蚕茧单丝的光谱。
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图5。五种不同B. Mori丝纤维的标准化光谱记录在0°和90°。
记录在54.7°的结构谱和从a计算的结构谱为(0°)和一个⊥(90°)如图6所示。
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图6。在55°录制的单纤维的ATR光谱和独立于方向的频谱A0从0°和90°谱计算。
结论
本研究为常规分析小单纤维提供了一种简便的方法，可以克服TR和透射实验的局限性。完全重现性，这可以通过使用我们实验室开发的样品夹来实现。尽管两个光谱足以计算出取向阶参数和各向同性光谱，但可以从本研究中描述的不同角度的测量确定再现性的稳健性。多角度测量也有利于验证带合过程，这是提取与不同振动胺I模相关的定量信息的必要步骤。
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