用μDawn和Optilab UT-REX测量超高效液相色谱中的绝对摩尔质量

尺寸排阻色谱（SEC）是用于在生物分子样品中表征碎片和聚集体的常用技术。理想情况下，SEC的洗脱由流体动力半径而不是摩尔质量来控制。传统的SEC取决于参考标准，以便作为摩尔质量的函数校准柱洗脱时间，假设感兴趣的分析物具有与标准相同的构象和化学成分。

然而，实际样品的分离往往不能用这些标准来准确表示。即使构象与标准品相似(这是很少的情况)，真实的样品可能会表现出柱间的相互作用，从而改变相对于标准品的洗脱特性。当SEC与minida™TREOS等光散射探测器耦合时^®，它可以量化分子的绝对摩尔质量，而不管洗脱时间。

超高效液相色谱（UHPLC）

UHPLC促进了生物分子样品的快速，有效地分离。UHP-SEC具有超过标准秒的几个优点，例如较高的产量，提高分辨率，溶剂消耗量，较小的样品体积，用于分析有价值的生物样品。用于标准HPLC的探测器由于过度分散而不能用于UHP-SEC。WyattμDawn.^TM值多角度光散射(MALS)探测器(图1)和Optilab.^®UT-rEX^TM值折射率(RI)探测器是专门为UHPLC应用而设计的。这种组合可以在UHPLC中测量洗脱物质的绝对分子量(或摩尔质量)和大小。

图1。怀亚特曙光MALS探测器。

UHPLC分析与μDawn和Optilab UT-REX的优点

与常规HPLC（图2，蓝色）相比，完成少于5分钟以完成整个UHPLC分析（图2，红色），其通常需要30分钟或更长时间。在这两种情况下，MALS测量光散射强度和RI浓度，用于计算每个峰的摩尔质量。

图2。光散射数据和测定蛋白质的摩尔质量，用UHPLC分离，用标准HPLC覆盖的DAWN和UT-rEX(红色)，用miniDAWN TREOS和Optilab T-rEX(蓝色)检测。

图2覆盖了通过Minidax Treos和Optilab T-Rex测量的单体，二聚体和聚集摩尔质量的色谱图^TM值对于标准的Sec-MALS，由μDAWN和OPTILAB UT-REX用于UHPLC-SEC-MALS。图2中的顶部图描绘了色谱图作为洗脱时间的函数。作为列卷的函数，在图2中的底部图中重新安装相同的数据，以便于比较。每个峰的摩尔质量的完美一致性揭示了将现有的HPLC技术迁移到UHPLC的可能性，而不会影响分子量数据的准确性和质量。

除了缩短分析时间之外，胎圈尺寸低于2μm的UHPLC固定相提高了​​聚集体和片段峰的分辨率。由于标准柱和探测器的大型内部体积而导致的分散扩大了这些微小的峰值，导致某些不良物种的“消失”，如图3中所示的片段为蓝色迹线。

图3。用UHPLC(红色)和标准HPLC(蓝色)分离的蛋白质的光散射数据和摩尔质量的测量。

该µDAWN设计为最小的内体积，以保持UHPLC洗脱轮廓的分辨率，从而有助于检测和调查以前未知的物种。图3中的方框显示的是只能用UHPLC分离的片段峰。图3的底部图显示了一个放大视图，显示了碎片和它的摩尔质量，由µDAWN测量。

通过RI检测大大提高了片段分析，普遍适用的在线浓度测量方法仅取决于相对于溶剂的分析物的折射率增量（DN / DC）。所有蛋白质的折射率增量几乎是恒定的。因此，与基于紫外线的浓度测量不同，不需要确定片段的身份，以确定峰的消光系数以定量洗脱浓度和摩尔质量。实际上，可以采用UV和RI检测的组合来了解每个物种的消光系数并有助于其识别。

结论

μdawn不仅衡量绝对分子量，还提供了用MiniDax Treos对UHPLC进行的所有深度分析。与标准HPLC-MALS一样，UHPLC-MALS峰值的摩尔质量的变化测量生物聚合物的多分散性或验证可逆蛋白质寡聚化。用UV，MALS和RI进行三倍检测促进蛋白质缀合物分析以确定翻译后修饰，相关洗涤剂，药物 - 缀合物或其他添加到多肽背景的程度。

该µDAWN复制了10-50 nm的rms半径范围(Rg，旋转半径)，可用于三个角度的最小DAWN。此外，可选的动态光散射(DLS)检测与WyattQELS™模块量化流体力学半径从0.5到40 nm与MALS检测相同的测量体积。

参考

改编自“UHPLC中绝对摩尔质量，通过μ DAWN和UT-rEX，”白皮书由怀亚特技术。图表和插图转载从怀亚特技术的许可。

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