大分子在溶液中的自缔合，包括胰岛素1，2，可以用合成梯度多角度光散射(CG-MALS)进行量化。CG-MALS能够快速、可重复、无标记的生物分子自联想定量。该技术测量重量-平均摩尔质量的变化作为浓度的函数，以确定这些相互作用的绝对化学计量和亲和度。而胰岛素自相关半定量研究可通过MALS仪器与尺寸排斥色谱相结合进行3.这篇文章描述了使用CG-MALS量化胰岛素在中性pH下无锌情况下的自结合，确定一个渐进的等轴自组装过程。
样品制备及仪器
人胰岛素样品在20mM磷酸钠pH 7.2, 0.1M NaCl, 1mM EDTA组成的缓冲液中制备，并在276nm处测量消光系数为1.05 AU/(g/L*cm)。胰岛素溶液和缓冲液用孔径为0.02µm的antop针尖过滤器过滤，2500g离心15分钟。实验在25°C下重复进行，使用两种浓度为3.2mg/ml或0.3mg/ml的库存。
CG-MALS实验采用a海中女神二世产生浓度梯度与岛津制作所SPD-6AV UV / Vis光谱仪和mini-DAWN心心three-angle光散射光度计(图1)。海中女神软件被用来适应不同self-association光散射和浓度数据模型来确定最佳划定的协会计划数据。
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图1所示。海中女神的硬件设置。
实验结果
正如预期的那样，测量到的胰岛素的光散射和浓度数据具有自缔合分子的特征(图2)w在这些条件下(38kDa)是六聚体，摩尔质量随浓度的增加不能用单体-六聚体平衡的简单模型来描述6和平衡缔合常数K一个=我6] /[我]6．如图2所示，当浓度在~0.2mg/mL(34µM)以下时，这种类型的组装会将测量到的Mw低估高达30%，而当浓度在0.2 ~ 2mg/mL(34-340µM)之间时，则会高估高达25%。
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图2。测量到的LS信号作为浓度的函数(蓝钻石)明显大于与M无相互作用的单体的预期LS信号w= 6kDa(灰色线)。
相反，光散射和浓度数据最好的拟合是一个等轴自组装模型。根据该模型，每个胰岛素单体以如下方式偶联到一个不断增长的、具有恒定亲和力的胰岛素簇:
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平衡结合常数K2与每个结合位点的亲和力K有关D= 1 / K2．对于图2和图3所示的数据，最好的拟合是具有亲和K的等轴自组装D= 52µM。
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图3。M的增加w作为浓度的函数，对应于等键自缔合(实线)，而不是单体-六聚体平衡的简单模型(虚线)的特征。
自缔合模型可以用来计算低聚物的平衡分布，如图4所示。当总浓度达到等键结合位点亲和力(~50µM或0.3mg/mL)时，胰岛素分子自缔合，溶液中单体组分迅速减少，表明胰岛素分子自缔合。浓度在~0.6mg/mL(~100µM)以上时，即使是二聚体部分也会降低，因为会形成更高阶的低聚体。
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图4。物种的平衡分布。
在最大浓度(~500 μ M)下，单体仅占27% mol/mol，二聚体仅占20% mol/mol。图4提供了高达15-mers的摩尔组成，代表0.3% mol/mol的原液。
结论
结果清楚地证明了CG-MALS定量人胰岛素在缺锌情况下等轴自组装的能力。尽管总体分子量仅比研究的浓度(~0.3-3mg/mL， ~5-500 μ M)增加了约6倍，但简单的单体-六聚体平衡法并不能很好地描述分子量随浓度的变化。相反，平衡状态下复合物的真实描述需要考虑更高阶的胰岛素寡聚，包括在这些条件下含有>10-mer的物种。
参考文献
改编自怀亚特技术公司的“CG-MALS定量胰岛素的自关联”白皮书。图表和插图转载从怀亚特技术的许可。
- 阿伦·k·阿特里，克里斯蒂娜Fernández，艾伦·p·明顿。,(2010)。浓度梯度静态光散射表征的ph依赖性无锌胰岛素的自缔合。Biophys。化学。，第148卷，28-33卷。
- 阿伦·k·阿特里，克里斯蒂娜Fernández，艾伦·p·明顿。，(2010)中性pH下锌-胰岛素的自缔合:浓度梯度-静态和动态光散射研究。生物物理学报，Vol. 23, no . 1, no . 2。
- 柱色谱(SEC/GPC)和MALS在表征胰岛素单体、二聚体、六聚体和聚集体中的应用
这些信息已经从Wyatt Technology提供的材料中获得、审查和改编。亚博网站下载
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