应用柱层析法(秒/ GPC)和mal描述单体、二聚体、五个一和胰岛素总量

在蛋白质和多肽的分析中,知识分子的低聚物的状态帮助科学家确定蛋白质的生物活性形式存在。确定低聚物的状态的第一步通常是分离的分子物种及其特征尺寸排阻色谱(SEC)。

理想情况下,证券交易委员会将根据流体力学体积分子并确定校准摩尔质量的保留时间与标准相同的分子构象和化学成分的分子的兴趣。在许多情况下,这是分析不成功,因为相关分子标准没有可用的或由于非理想之间的交互分析物和列包装材料。SEC的耦合光散射克服这个限制,并允许绝对描述的淋洗大分子的摩尔质量和低聚物的状态。

多角度光散射(mal)是第一原理方法量化大分子的摩尔质量的解决方案。这种技术没有假设分子的结构,和不需要摩尔质量标准。以前的研究也表明胰岛素低聚物的分离和SEC的检测光散射技术^{1 - 2}。此外,composition-gradient发作(CG-MALS)测量被用来确定胰岛素的亲和力和stochiometry协会^{3 - 5}。本文描述了缓冲区组成和样品浓度的影响胰岛素的寡聚物被SEC耦合mal (SEC-MALS)。

仪器和实验过程

SEC的执行使用安捷伦1260液相色谱系统加上一个权力平等主义的泵,自动取样器和脱气装置。通用电气医疗集团的Superose 12 300/10是用作分离柱。

一个安捷伦可变波长检测器280海里,一个黎明^®HELEOS^®18角光散射检测器和一个Optilab^®雷克斯™示差折光检测器被用于检测(图1)。怀亚特阿斯特拉是技术^®软件是用于SEC-MALS分析。

图1所示。仪器分析。

流动相组成140毫米氯化钠,10毫米三,2毫米苯酚和200 ppm NaN3 pH值7.7。三个不同的胰岛素样本准备所有包含0.6毫米胰岛素进行了分析。没有添加锌样本1)胰岛素类似物;样本2)与0.1毫米人类胰岛素锌;与0.3毫米和样本3)人类胰岛素锌。

实验结果

在缺乏锌、胰岛素分子形成二聚体和其他低聚物,可以由证券交易委员会和由光散射分析。图2显示了示例1的结果与摩尔质量代表整个色谱。主要的分数测量5.8 kDa的摩尔质量,对应于胰岛素单体。这个物种是解决从次要分数对应的六聚体摩尔质量~ 35 kDa。此外,光散射信号表明,测量摩尔质量的二次峰值包括一系列的寡聚物从单体hexamer-a结论不能单独从紫外信号。应该强调,因为光散射是极其敏感的高分子量的物种,mal确定了六聚物容易即使很少的紫外线信号存在。

图2。情节的摩尔质量与样品1的时间。280纳米的紫外线信号是策划作为一个覆盖。摩尔质量计算使用DRI和LS。

相比之下,大多数样本2(0.1毫米)锌是一种六聚体(图3中,蓝色),以及似乎正在经历一个重要部分monomer-dimer平衡。较低分子量峰洗提略快于单体峰为样本1和measured-molar质量是整个peak-spanning异构单体和二聚体的质量(~ 6 - 12 kDa)。

图3。情节的摩尔质量与时间的样本1和2 (mono-mer、二聚体、六聚物)。280纳米的紫外线信号是策划作为一个覆盖。摩尔质量计算使用DRI和LS。

进一步增加锌(0.3毫米)完全转变平衡向六聚物见示例3(图4)。另外,结果显示另一个分子的存在胰岛素分子的物种鉴定为dodecamer样品3。虽然含量低,这个峰值产生一个明显的信号容易观察到LS探测器。

图4。情节的摩尔质量与样品1和3。280纳米的紫外线信号是策划作为一个覆盖。摩尔质量计算使用DRI和LS。

SEC-MALS允许半定量估算一个可逆self-association的力量。增加注入量列增加蛋白质含量总体上穿过探测器,从而改变洗脱液的平衡向低聚物的复合物。样品2和3,平衡的变化协会被注入µL 50或者200调查μL相同的样品溶液在美国证券交易委员会(SEC)列。

注入体积的增加显然会影响样品的平衡2(图5)。作为一个更高的胰岛素浓度,monomer-dimer均衡转向二聚体和高阶低聚物。最低的摩尔质量测量观察50μL注入~ 6 kDa,相应的单体。然而,最小的测量摩尔质量为200年µL注射用二聚体的摩尔质量一致。六聚体分数增加洗脱浓度的影响,没有形成大寡聚物的倾向。

图5。情节的摩尔质量与示例3。作为一个覆盖DRI信号绘制。紫外信号饱和是由于高负荷样本。摩尔质量计算使用DRI和LS数据。

在示例3的情况下,基本上没有改变注入体积的影响(图6)。在0.3毫米锌的存在,系统“锁定”的六聚体形式和相同的摩尔质量是决定在浓度(50和200μl注入)。也没有增加dodecamer的质量分数。明显的self-association行为大大不同于单体的六聚体。

图6。情节的摩尔质量与示例3。作为一个覆盖DRI信号绘制。紫外信号饱和是由于高负荷样本。摩尔质量计算使用DRI和LS数据。

结论

结果清楚地显示的能力SEC-MALS分析协会现象不仅对大型蛋白质,如抗体,而且对肽分子分子质量较低。由于蛋白质和肽用于治疗目的的使用不断增加,光散射的应用作为一个强大的分子鉴定方法也将变得越来越重要。

引用

改编自“使用SEC-MALS识别胰岛素低聚物的国家”白皮书,P。Wahlund, d . Roessner和运动员。图表和插图从怀亚特技术允许转载。

1。m·h·延森P.-O。Wahlund, j·k·雅各布森,b . Vestergaard m . van de Weert Havelund。,(2011)。Self-association长效胰岛素类似物尺寸排阻色谱法研究了耦合多角度光散射。色谱法B学报,879 (28),2945 - 2951。

2。,反观美国Havelund t . Hoeg-Jensen d . b . Steensgaard P.-O。Wahlund, Ribel。,(2012)。小说胰岛素Degludec伸长机制,设计一个Ultra-long-Acting基础胰岛素。医药研究,29 (8),2104 - 2114。

3所示。阿伦•k•素质克里斯蒂娜•费尔南德斯,艾伦·p·明顿。,(2010)。pH-dependent self-association zinc-free胰岛素浓度梯度静态光散射的特征。Biophys。化学。卷。148年,只愿降价。

4所示。阿伦•k•素质克里斯蒂娜•费尔南德斯,艾伦·p·明顿。(2010)的Zn-insulin Self-association中性pH值:调查gradient-static浓度和动态光散射。生物物理J。卷。148年,汽车出行。

5。量化Self-Association胰岛素在中性pH值使用Composition-gradient多角度光散射技术。

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