测量荧光发射的退偏振

荧光各向异性决定了荧光发射的去极化。退极化的关键原因是布朗运动引起的能量转移到另一个不同方向的分子或分子旋转。分子运动是基于局部环境因素，如分子约束，并且是基于局部环境因素，如粘度和分子约束，以及分子的大小。因此，测量荧光各向异性对于获取分子大小和迁移率的信息是有用的。

分子旋转

大多数荧光团以一个与它们的吸收偶极子平行的优选方向吸收光。如果用偏振光激发样品，那么只有吸收偶极平行于该光的分子的一个子集会被激发。被激发的分子不是静态的，布朗运动使这个子集变得无序。随着时间的推移，随机取向的分子会发出荧光。通过监测平行和垂直的偏振面，可以沿着这条路径从有序到无序，如图1所示。

图1。在垂直偏振光的吸收后分子旋转的示意图，其从随机取向发射（假设吸收和发射偶极和平行）。指示具有时间（蓝轴）的各向异性（红色轴）的变化。

衡量标准是荧光各向异性，R.，涉及强度（我）极化的平面（↕，↔），定义为，

在最简单的情况下，各向异性随时间的变化为:

在哪里R.₀是初始各向异性，范围为0.4（平行过渡偶极子）至-0.2（垂直偶极子）。在使用2-光子激励的同时，这些值不同。

τ._R.是旋转相关时间，可以被认为是秩序紊乱过程的量度。稳态各向异性可由：

尽管测量很简单，但与时间解析测量相比，这提供了对过程的不完整描述，而时间解析测量使R.₀和τ_R.，以及荧光寿命，尚待确定。旋转相关时间可与旋转扩散系数(D_R.）在最简单的情况下，通过以下情况下的有效量（v）和局部粘度（η），

在这里k是玻尔兹曼常数，T是绝对温度。因此，时间分辨测量返回τ值_R.可用于提供有关分子大小和包含分子的介质流动性的信息。然而，在解释时需要注意，因为只有等效粘度和相对变化才能实际确定。

阻碍旋转

如果荧光团不能完全自由旋转，则可以考虑一个非零的极限各向异性，表现在下面的各向异性衰变中(图2)。

图2。说明各向异性衰变的极限值

时间分辨测量如下所示:

在考虑“在锥形上摆动”模型的同时，初始和限制各向异性的比率可用于计算半角度，这反映了分子所在培养基所锻炼的取向约束程度。

时间分辨测量

在测量时间分辨各向异性的同时需要考虑某些实际考虑因素。以下一些方面如下所示：

探测分子的选择——探测的寿命应该与τ相似_R.．如果寿命比τ短得多_R.在分子旋转完成之前，荧光结束，确定有问题的。

app亚博体育设备分化的偏见

单色仪和探测器可能对一个偏振面有偏置。应进行校正(g因子)测量，包括对样品使用水平偏振激发入射。注意，g因子与波长有关，因此如果使用不同的测量条件，需要重复。

适合差异或原始各向异性数据

原始各向异性数据中可能包含仪器畸变，因此适合于差分文件(由数据分析获得，与第一个方程中的分子有关)是可取的。利用再卷积消除了这种失真，并恢复了较短的旋转相关时间。

极化测量的额外使用

必须注意的是，在激励具有快速偏振激光脉冲的样本的同时，可以存在极化效果。这导致常规荧光腐烂看起来更复杂，可能与去极化效应有关。建议在激发偏振器和发射偏振器上使用一个垂直方向的偏振器，以魔术角度(垂直54.7°)消除这些去极化效应。

应用程序

应用程序:

• 揭开同性恋者
• 分子相互作用/结合
• 能量迁移
• 局部粘度
• 分子限制
• 膜相变

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