分析高性能液相色谱（HPLC）广泛用作鉴定和定量样品中存在的分子物种的方法。HPLC系统包括一系列在线检测器，包括UV / Vis吸收，荧光，蒸发光散射（ELS）和质谱（MS）。
差分折射率检测（DRI）也是常见的，提供各种HPLC应用，该应用范围从小分子到蛋白质，石油，多糖和合成聚合物。
超高效液相色谱（UHPLC）在应用和概念上与HPLC相似，但用较小的柱式操作，用较小的珠子紧密包装。本文介绍了基于内陆RI UHPLC检测器的几个基本UHPLC分析。可以从这些示例中观察到，在线UHPLC DRI检测器不会损害UHPLC分辨率。
所涵盖的应用包括柱校准，基于UV：DRI的比率的洗脱材料之间的判别，对不同注入的质量的响应线性，检测非UV-活性杂质，以及检测溶剂梯度背景的样品峰值亚博网站下载。
蛋白质片段或杂质
牛血清白蛋白（BSA）是用于校准蛋白质定量和浓度测量的常用试剂。尽管BSA的单体含量高达97-98％，但溶液中的少量蛋白质材料是不是BSA单体。大多数额外的蛋白质是BSA（即二聚体和修剪剂）的不可逆聚集体。通过HPLC尺寸排除色谱法清楚地分析和检测这些浓度无关的低聚物（SEC-MALS）。
通过UHPLC的高分辨率分离导致BSA中的一个新特征，比主要单体晚在的小峰，如图1所示。
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图1。通过UHPLC，具有300mm尺寸排除柱和UV + UT-REX RI的BSA中检测到的次要杂质或片段。片段相对于单体和二聚体的不同UV：Ri比例表示不同的主要组合物。
DRI色谱迹线显示出一个新的峰值。该峰值有三倍的来源，一种错误的BSA单体，BSA或外部分子的片段。整个BSA分子如聚集体或错过折叠蛋白的任何变体具有相同的组成比，因此具有恒定的紫外线：Ri比率;（例如，BSA二聚体表现出与单体相同的比例）。这紫外线：Ri比率新峰值高于单体的60-70％，暗示新物种相对于单体富含UV-活性材料，因此不能是骨料或错误的BSA。它必须是外国或片段。
异构体
尺寸排除柱与大分子之间的相互作用主要是流体动力学。因此，任何给定物种的洗脱时间受分子的形状和大小的控制。具有相同摩尔质量但不同构象的蛋白质与柱子珠子相互作用，以在略微不同的时间内洗脱。标准HPLC.除非它们具有差异不同的形状
通用检测和列校准
大多数检测技术具有依赖性或特定的样本限制。UV或荧光分析要求样品含有合适的UV-活性发色团，并且蒸发光散射需要挥发性溶剂。与DRI相容的部分样品列表是：蛋白质，碳水化合物，寡核苷酸，脂质，小分子药物化合物和油。图2显示了在线UHPLC DRI检测器如何结合使用用于分离糖的反向相位UHPLC柱。
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图2。在UHPLC柱上的糖分离，由UT-rex检测到。
紫外 - 无活性杂质检测
紫外线活性物质的质量控制，例如蛋白质，通常包括包含UV检测器的分析UHPLC-SEC。然而，样品中存在的杂质可能并不总是含有发色团，因此通过未检测到。在这种情况下，掺假样品将通过QC测试滑动，而不会升高任何警告标志。
对溶剂梯度的样品检测
通常溶剂梯度伴随着流动相的折射率，压倒性和饱和大多数在线差分折射率探测器的相当大的变化。虽然偏好通常在基于梯度的分离中使用不同的检测技术，但是有时RI可以是唯一可用的选项。图3显示了反相曲言/水梯度的分析。
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图3。分析反相乙腈/水梯度，10％→90％，DRI。样品是溶菌酶。TOP：具有250μg注射溶菌酶的原始数据，在大幅改变的RI信号上看起来是一个小功能。底部：基线减法后，这次从25μg注射溶菌酶（其实际上是针对梯度基线的）。早洗，小峰未识别。
结论
折射率检测给obhlc提供了许多重要的益处。作为通用探测器，在线UHPLC DRI检测器（例如Optilab®UT-rex™从Wyatt技术）可以单独操作，作为UHPLC柱下游的唯一在线检测器，或与另一种检测器组合，例如UV / Vis吸收。
可以实现高数据速率扫描和低峰值扩展，以确保不损害UHPLC的改进分辨率。独立检测模式适用于那些不适合于其他测量技术的样品，例如含水，非挥发性溶液或吸收紫外线中的溶剂中的糖蛋白。紫外线：Ri比也可以分析以确定缀合物分子的组成（例如，蛋白质碳水化合物生物治疗剂）。这种额外的功能对UHPLC分析增加了显着的值。
这个内容已经存在根据许可转载从“UHPLC折射率检测的好处”由DAN有限公司，2013年。亚太地区生物技术新闻，第17卷，第9号，PG。26-28。
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