在基于蛋白质的治疗化合物的发育过程中可能在任何阶段进行蛋白质聚集。已经开发了几种光散射方法的表征，通过应用正交方法来确定治疗制剂中的蛋白质聚集组合物。
蛋白质聚集是在治疗蛋白质产品的储存，制造，给药和运输期间发生的现象。由于蛋白质聚集体可以大大影响治疗剂的功效，稳定性和安全性，必须在生产过程的每个步骤中表征它们的尺寸和丰度。通常，蛋白质聚集体的尺寸从几纳米到数百微米不同。
静态和动态光散射技术
光散射(LS)技术，包括静态光散射(SLS)和动态光散射(DLS)技术，已被用于表征从几个纳米(单体/低阶低聚物)到微米(高阶聚集体和聚集体颗粒)直径的蛋白质聚集体。yabo214光散射信号的强度与溶液(或稳定的悬浮液)中物质的摩尔质量和浓度成正比。
因此，即使少量，光散射检测器在检测大的聚集体时是高敏感的。此外，现代SLS和DLS探测器可以耦合到诸如尺寸排阻色谱（SEC）和场流分馏（FFF）的在线分馏技术，从而允许蛋白质制剂中存在的不同亚物种的优异分辨率和广泛表征。
尽管两个单独的分子都基于其流体动力学体积，但秒通常用于蛋白质分离;虽然，FFF可用于蛋白质和纳米颗粒。yabo214SEC在大多数实验室中是常见的，并且已经比FFF更广泛地利用，以分离和量化来自片段和聚集体的稳定蛋白质同种型。
静态光散射可包括低角度（LAL），直角（RALS）和多角度LS（MAL），并且MALS是最准确的，多功能，广泛利用的聚合物和生物聚合物表征的检测器。这如图1所示。
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图1.分离蛋白质单体和聚集体的测定是通过尺寸排除色谱(SEC)或不对称流场-流分馏(AF4)完成的。在线分析摩尔质量和尺寸使用多角度光散射(MALS)，动态光散射(DLS)，紫外/可见吸收(UV)，和差示折射(dRI)。
MALS检测器可用于批处理模式，也可与SEC或FFF分离相结合。重要的是，在SEC或FFF中添加MALS检测器可提供绝对分子量(即，独立于几何形状、密度和蛋白质单体和聚集体的分离是通过尺寸排除色谱[SEC]或不对称流场-流分馏[AF4])。
摩尔质量和尺寸的在线分析利用多角光散射（MALS），动态光散射（DLS），UV / vis.吸收(紫外线）和差分折射测定法（dRI)，还可提供其他信息，如蛋白质偶联物的化学计量、半径的均方根(rg.当大于10nm时，或者在其他参数中的聚集粒子的数量浓度数据。yabo214
聚集粒子结构的测定
为了测量小于10nm的蛋白质半径或确定团聚颗粒的结构，DLS也可以与SEC或FFF下游的MALS一起使用，以提供洗脱物种的流体力学半径(Rh)。yabo214
对于蛋白质，MALS (MW)和DLS (DLS)的综合信息(RH.)可以对分子的构象或折叠态提供一些见解。对于较大的物种,根的比例意味着广场半径和水力半径(分别从mal和DLS)不仅可以使用派生的颗粒形状也测定粒子内的质量分布(例如,区分空和填充纳米笼)。
为了准确地确定蛋白质聚集物的分布，通常采用不分离的批处理模式进行MALS或DLS测量。批次分析是DLS的主要应用模式，可用于监测聚集作为各种参数的函数，如浓度、缓冲液组成、温度和时间。与MALS相比，DLS不需要事先了解浓度。
这些因素以及在不到一分钟的下划线批量DL中进行测量的能力，作为配方稳定性的高通量筛选的有用工具，特别是使用自动化DLS仪表，具有井板。
尽管对微小聚集物的存在非常敏感，但批量DLS对亚种的分辨率要求它们的半径至少相差4倍。低阶低聚物的演化只能用替代的度量(如多分散度指数)作为代理来监测。当然，这并不是一个限制，因为在线DLS遵循分段。
与DLS一样，批量MALS在有限分辨率下测量样品中不同物种的平均MW。然而，相比之下，MALS在评估批次之间的差异时远比DLS敏感。在最佳条件下，批次MALS可以很容易地感觉到平均MW的1%变化，这是由溶液中聚集体的类型或数量的微小差异引起的。当在不同浓度下测量时，批量MALS数据可用于表征蛋白质的可逆自缔合，在大浓度范围内解析和量化样品中存在的不同低聚物。
结论
总之，两个基本类型的光散射检测，静态和动态，通常用于表征生物治疗制剂的发展中的物理性质。两种类型可用于批量分析或与各种分馏技术结合改进的检测/表征。
分馏后的光散射（通过秒或FFF）能够在不可逆地相关的蛋白质溶液中表征和分离不同的聚集体;然而，分离过程本身有时可以改变样品中的聚合状态和/或内容。
这样的扰动在批量测量中不会发生。相比之下，尽管不同物种的分辨率有限，批分析是高通量筛选促进蛋白质聚集的溶液条件以及表征各种特异性和非特异性结合的强大手段。任何这些正交但互补的方法独立提供有用的信息，当一起使用时，它们组成了一个强大的工具包，全面表征蛋白质配方中的聚集现象。
参考和进一步阅读
- 允许转载来自Michelle Chen, 2013年的《表征蛋白质聚集的方法》。Sp2 InterActive, 2013年11月/ 12月，第20-22页。
这些信息已经从Wyatt Technology提供的材料中获得、审查和改编。亚博网站下载
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